1株血红蛋白分解菌的分离鉴定及其蛋白酶活力测定

周雪雁， 米玛普尺， 马咸莹， 马忠仁1,， 丁功涛1,*

(1.西北民族大学 生命科学与工程学院，甘肃 兰州 730124；2.西北民族大学 生物医学研究中心，甘肃 兰州 730030)

屠宰场废弃血污不经过处理直接排放，会对环境中土壤和水源造成污染。传统的处理方法有填埋法、消毒灭菌法和焚烧法。填埋法易造成地表环境、地下水资源污染。采用消毒液进行消毒灭菌，不能保证消毒灭菌的彻底性，容易对周围环境造成二次污染。焚烧法处理也会造成大气污染，且废弃物中所含的蛋白资源不能得到有效利用。相比之下，利用微生物降解废弃血液生产氨基酸液态肥料，可在保护环境的同时实现资源的可持续发展，提高废弃蛋白附加值，被认为是畜禽血液综合利用的一个方向[1]。氨基酸肥料作为一种新型生态肥料，在农业生产中扮演的角色和发挥的作用将越来越重要[2]，其市场前景看好[3]。本研究以日喀则地区屠宰场血污堆积土壤为分离基质，筛选能够降解废弃血液血红蛋白质的细菌，并进行菌株鉴定和蛋白酶活力测定，旨在为屠宰场废弃血污的处理和资源化利用做出可行性的探索。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 试验样品 采集于西藏日喀则地区屠宰场废弃血污放置土壤，地理位置为西藏自治区日喀则市江孜县英雄路6号(经纬度：89°60′E， 28°92′N；海拔：4 000 m左右)。

1.1.2 培养基 ①LB培养基：胰化蛋白胨10 g/L，酵母提取粉5 g/L，氯化钠10 g/L；②牛肉膏蛋白胨基础培养基：牛肉膏5.0 g/L，蛋白胨10.0 g/L，NaCl 5.0 g/L，琼脂15 g/L，3%的血清；③哥伦比亚血平板(广东环凯微生物科技有限公司)：酪蛋白胰酶消化物、玉米淀粉、琼脂、新胰酶消化物、酵母浸出物、氯化钠(分析纯)、肉胃酶消化物、脱纤维羊血、蒸馏水；④液体发酵培养基(g/L)：玉米粉40,黄豆饼粉30,Na2HPO44,KH2PO40.3。

1.1.3 试剂 胰化蛋白胨(OXOID),酵母提取粉(OXOID),牛肉膏,蛋白胨,琼脂粉(青岛海博),氯化钠,NaOH(分析纯，天津市大茂化学试剂厂),血清(兰州民海生物工程有限公司),革兰染色试剂(博精索拉博科技有限公司),细菌生化鉴定管(杭州微生物试剂有限公司),福林酚试剂(分析纯，博精索拉博科技有限公司),三氯乙酸(分析纯，博精索拉博科技有限公司),干酪素(阿拉丁工业公司)。

1.1.4 仪器与设备 立式压力蒸汽灭菌器(YXQ-LS，上海博讯医疗生物仪器股份有限公司)，电热恒温鼓风干燥箱(DHG-9146A，上海精宏实验设备有限公司)，MOST-T蒸汽灭菌器(MOST-T，山东新华医疗器械股份有限公司)，电子天平(AR224CN，奥豪斯仪器常州有限公司)，立式恒温振荡器(IS-ROV1，上海智城分析仪器制造有限公司)，BME显微镜(13395H2X，莱卡)，洁净工作台(SW-CJ-1F，苏州安泰空气技术有限公司)，高速离心机(Pico17，BioRad)，电泳仪(北京六一仪器设备)，微波炉(广东格兰仕)。

1.2 方法

1.2.1 样品采集及菌株的分离纯化 用无菌离心管收集屠宰场废弃血液存放地土壤带回实验室，取出适量的样品，用无菌水进行10-4～10-6梯度稀释，吸取适量土壤悬液涂布于哥伦比亚血平板，37 ℃恒温培养48 h，挑取透明水解圈最大的菌落进一步划线接种在血平板上进行纯化， 37 ℃培养24 h，纯化操作可进行2～3次，将分离纯化好的菌株用甘油冻存。

1.2.2 形态学鉴定 将分离得到的菌株划线接种于牛肉膏蛋白胨琼脂或LB固体培养基上，37 ℃培养48 h，观察菌落形状、大小、颜色、边缘、隆起、透明度等。挑取少量菌落革兰染色后镜检，在光学显微镜油镜下观察菌体细胞的形状、大小及染色结果[4]。

1.2.3 生化反应试验鉴定 用LB液体培养基培养分离菌株24 h至对数生长期，将50 μL菌液分别接入糖酵解试验、硝酸盐还原、氨基酸水解、枸橼酸盐利用、甘露醇利用、卫茅醇利用、蛋白胨水解、尿素利用、产硫化氢、淀粉、明胶等生化反应管中培养。按生化管中说明情况分别培养至指定时间，取出培养的生化管进行观察，记录判定其反应结果，反应结果组成该菌的生化图谱，用作菌种鉴定[5]。

1.2.4 16S rDNA序列鉴定 制备PCR反应模板DNA，取1 mL菌液于1.5 mL离心管中，12 000 g离心2 min，弃上清液，再加500 μL的 无菌去离子水制成菌悬液，将菌悬液99 ℃加热10 min，-70 ℃下冷冲击20 min，循环3次，循环结束的菌液12 000 g离心5 min，取其上清液作为PCR扩增的模板。16S rDNA通用引物为27F(5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′)和1492R(5′-GGTTACCTTGTTACGACTT-3′)。PCR反应体系为25 μL，其中2×TaqMix 12.5 μL，F引物2 μL，R引物2 μL，无菌去离子水 7 μL，模板1.5 μL，将各组分按以上顺序依次加入到PCR反应管中，瞬离10 s混匀后，用PCR扩增仪进行扩增反应。PCR反应条件为预变性95 ℃，5 min；变性95 ℃，30 s，退火55 ℃，30 s，延伸72 ℃，1 min，进行30个循环；最后延伸72 ℃，10 min，4 ℃保存。PCR产物用电泳鉴定，配制1%琼脂糖胶溶液50 mL，煮沸冷却2～3 min后加入5 μL核酸染料，摇匀，倒入胶槽后冷却20～30 min，待胶完全凝好后使用。胶块制好后取3 μL PCR产物和DL2000 DNAMarker分别在胶孔内点祥，120 V，电泳15～20 min。电泳结束后，取出胶块在紫外成像仪下观察PCR产物在胶块中的位置，对电泳结果进行照相和分析，将正确扩增的PCR产物送至北京擎科生物技术有限公司进行测序。将测序结果序列输入NCBI进行Nucleotide BLAST(https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast)[6]，并使用MEGA 7.0构建系统发育树[7]。

1.2.5 蛋白酶活力测定 福林酚法(Folin试剂法QB747-80)测定分离菌株的产蛋白酶活力[8-9]，首先绘制酶活标准曲线，取不同质量浓度(0～100 μg/mL)酪氨酸标准溶液1 mL，各加入5 mL的0.4 mol/L碳酸钠溶液，1 mL福林(Folin)试剂，于40 ℃下恒温水浴显色30 min，分光光度计680 nm波长下比色测定吸光度值(OD值)，用空白管(酪氨酸为0 μg/mL)作对照，以酪氨酸浓度为纵坐标，以吸光度值为横坐标，绘制标准曲线，求出光密度为1时相当的酪氨酸质量(μg)，即为K值。然后将分离菌株接种到液体发酵培养基37 ℃、200 r/min摇床扩大培养至48 h，过滤去除菌体，滤液中的蛋白酶用(NH4)2SO4沉淀后再经透析袋透析获得粗酶液[10]。将1 mL粗酶液和1 mL底物酪蛋白(20 g/L)在40 ℃条件下保温精确反应10 min，然后立即加入3 mL 0.4 mol/L三氯乙酸终止反应。静置15 min，使蛋白质沉淀完全，然后用滤纸过滤，滤液应清亮，无絮状物，取上清滤液1 mL加入5 mL 0.4 mol/L碳酸钠，混匀加入1 mL福林(Folin)试剂，混匀后 40 ℃水浴保温20 min。分光光度计测定样品在680 nm波长处的OD值。同时做空白对照(酶液不进行40 ℃水浴保温反应)。碱性蛋白酶活力单位U，以每毫升样品在40 ℃，pH 11条件下，每分钟水解酪蛋白产生的酪氨酸质量(μg)来表示，按下式计算酶活力值[8]。

式中，X：样品的酶活力；K：由标准曲线得出的光密度为1时相当的酪氨酸质量(μg)；A：样品OD值与空白OD值之差；N：样品的稀释倍数；5：测定中吸取的滤液是全部滤液的1/5；10：酶反应时间10 min，以1 min计。

2 结果与分析

2.1 菌株的分离纯化

将筛选得到的菌种平板划线接种至血平板，置于37 ℃恒温培养箱培养24 h后，分离纯化后菌株的菌落形态为圆形、黏稠、湿润、白色，直径为2.8～3.5 mm，透明水解圈的大小约4.0 mm。在营养琼脂培养基上的菌落表面粗糙皱褶，边缘不整齐扩展，白色，不透明，粘着，24 h后菌落直径约为3 mm。

2.2 革兰染色

经革兰染色，分离菌株为杆状菌，菌体细胞呈蓝紫色，鉴定革兰阳性菌(图1)。

图1 分离菌株革兰染色结果Fig.1 Gram staining result of the isolate

2.3 生化反应试验

分离菌株生化反应特性鉴定结果(表1)显示，分离菌株不发酵乳糖、葡萄糖，V-P试验阳性，枸橼酸盐利用，淀粉水解，明胶液化，可产生DNA酶，不产硫化氢，不还原硝酸盐。根据芽胞杆菌生化谱进行分类，分离菌株为地衣芽胞杆菌。

表1 分离菌株生化反应试验结果

注：“+”：生化反应结果为阳性；“-”：生化反应结果为阴性

2.4 16S rDNA序列鉴定

2.4.1 琼脂糖凝胶电泳 电泳结果(图2)表明分离菌株NwMCC01910042的16S rDNA序列PCR扩增产物条带约为1 500 bp，最左边为DNA Marker。

2.4.2 菌株的16S rDNA序列分析 将得到的16S rDNA序列(1 420 bp)与NCBI已提交的序列进行Nucleotide BLAST比对。结果显示NwMCC0-1910042与BacilluslicheniformisATCC 14580株的序列相似性为99.79%，与BacilluslicheniformisMSL3076株的序列相似性为99.30%。将分离株菌的16S rDNA核酸序列和BLAST结果中的序列通过软件MEGA7.0进行多重比对并构建系统发育树(图3)。NwMCC01910042与地衣芽胞杆菌位于同一个分支上，同源性高达99%以上，具有较近的遗传距离，鉴定为地衣芽胞杆菌。

图2 PCR产物的琼脂糖凝胶电泳结果Fig.2 Agarose gel electrophoresis of PCR product

图3 基于16S rDNA基因序列建立的NwMCC01910042菌株系统进化树Fig.3 Phylogenetic tree of NwMCC01910042 strain based on 16S rDNA gene sequence

2.5 蛋白酶活力的测定

由酪氨酸标准曲线(图4)得到的K值为101.23。获得NwMCC01910042菌株粗酶液的蛋白酶活力为188.43 U/mL。

图4 酪氨酸标准曲线Fig.4 Standard curve of tyrosine

3 讨 论

利用微生物降解生产氨基酸有机肥的关键是筛选蛋白酶高产菌株。近年来，蛋白质分解功能菌株的收集工作取得了一定的成果，但功能菌株的转化利用研究不足。张滨等[11]从多年被废弃畜禽血液浸染的土壤中分离到1株蜡状芽胞杆菌(B.cereusLact5.Ⅲ)，其蛋白质水解圈比值较大，其在血红蛋白发酵培养基中发酵，所测定的蛋白酶活力达到483.81 U/mL。陶艳华等[12]从南京某屠宰场下水道中分离到1株短小芽胞杆菌(Bacilluspumilus)，其具有较强降解血红蛋白的能力，在血红蛋白发酵培养基中降解率达53.64%。李浩丽等[13]从华中农业大学附近菜市场新鲜猪血中分离到1株芽胞杆菌(BacilluspumilusCN8)，福林(Folin)法测定酶活为150.86 U/mL。Kong等[14]从腐败蚕蛹中筛选得到1株产中性蛋白酶的细菌，在pH值8.0、温度55 ℃处理0～30 min时的酶活较稳定，获得了1株能够高效分解蚕蛹蛋白的菌株。程宇等[15]在特定土壤中分离得到1株能够有效分解动物蹄角蛋白的菌株，该菌株对蹄角蛋白的分解率可以达到45.35%。通过形态学观察、生理生化特征及16S rDNA序列分析，鉴定该菌为枯草芽胞杆菌(Bacillussubtilis)。陈兴等[16]利用酪蛋白培养基，对醇化烟叶上分离到的细菌进行了定向筛选，得到了降解蛋白质能力较强的菌株(PE1)，其蛋白酶活性达到156.25 U/mL。庞伟[17]研究了3株不同的枯草芽胞杆菌，选用H/C值(菌落透明圈和菌落直径比值)较大和产酶能力较强的B3菌株作为优良菌株，以猪血粉为原料进行发酵，发酵后猪血粉的蛋白质含量下降了24.05%，氨基态氮含量增加了4.44倍，可溶蛋白含量增加了53.77%。为了将本研究的分离菌株有效地应用于氨基酸液体肥生产实践，项目后续将开展NwMCC01910042菌株对血污血红蛋白降解特性及降解产物氨基酸分析以及降解工艺优化实验[18-20]。从生物安全性要求方面，分离菌株的抗菌药物敏感试验性及毒性试验也需要进一步确定。

利用废弃血污蛋白物制备氨基酸有机肥料，不仅可以提高蛋白废弃物的经济价值，还可以减少环境污染，实现废弃资源的再利用。同时，氨基酸肥料作为一种新型的生态肥料，其使用范围也将会越来越广[21]。近年来有一些报道是以废弃蛋白为原料采用盐酸、硫酸或者烧碱水解的工艺来制备氨基酸液体肥，这种方法生产成本低，工艺较简单，但利用微生物降解工艺来生产氨基酸有机肥的工艺还不很成熟。刘娜等[22]以废弃革屑为原料，采用氧化钙水解革屑提取胶原蛋白，再用硫酸水解胶原蛋白制备微量元素型含氨基酸水溶肥料，最佳水解工艺为水解温度110 ℃，硫酸用量为胶原蛋白的1.25倍，水解率达到91%，液体中游离氨基酸总量为231 g/L，高出行业指标131%，制备的微量元素型含氨基酸水溶肥料符合液体产品的技术指标和重金属限量要求。但因为使用强酸强碱作为原料，容易对环境造成污染，国家已经严格禁止使用。相比之下，微生物降解法具有降解速率快、不易造成污染、反应条件温和，成本低，容易应用到工业生产中的优势。因此，以动物的血污、毛发及蹄脚等作为原料，采用微生物降解工艺生产氨基酸液体肥急待进一步研究和开发利用。