雷帕霉素通过mTORC1/HIF-1α信号调控人骨肉瘤细胞凋亡

王华磊，叶向阳，汤立新

研究证实哺乳动物雷帕霉素靶蛋白(mTOR)与人骨肉瘤细胞侵袭性密切相关[1-2]。文献报道,miR-144可抑制人骨肉瘤MG63细胞mTOR的活性，进而抑制细胞增殖和促进细胞凋亡，而mTOR抑制剂雷帕霉素能够显著增加人骨肉瘤MG63细胞凋亡[3-4]。缺氧诱导因子(HIF)-1α被报道与骨肉瘤患者的预后不良呈正相关[5]。骨肉瘤组织内部常处于缺氧状态，HIF-1α表达上调，促进骨肉瘤细胞的迁移[6]。有学者认为HIF-1α和mTOR相互作用是选择性小分子抑制剂治疗头颈部鳞状细胞癌的新型靶点[7]。缺氧条件下，侵袭性前列腺癌细胞中PI3K/Akt/mTOR信号通路活化，同时过表达HIF-1α，而mTOR抑制剂抑制mTOR活化，同时显著下调HIF-1α表达，进而降低前列腺癌细胞的侵袭能力[8]。但是，mTORC1/HIF-1α信号是否在骨肉瘤细胞中发挥重要的调控作用未查到文献报道。本研究探讨缺氧条件下雷帕霉素对人骨肉瘤MG63细胞凋亡的影响，为骨肉瘤的进一步研究提供新的理论依据，也为骨肉瘤的临床有效治疗提供新的作用靶点。

1 材料与方法

1.1 实验材料与仪器人骨肉瘤细胞系MG63(ATCC细胞库)；RPMI1640培养基、胰蛋白酶(Sigma公司)；胎牛血清(Hyclone公司)；青霉素、链霉素、RIPA裂解液、BCA蛋白定量试剂盒、化学发光(ECL)液(上海碧云天生物公司)；雷帕霉素(上海阿拉丁生化科技公司)；si-RNA转染试剂盒(Invitorgen公司)；兔抗人结节性硬化症(TSC)1抗体、兔抗人p-S6抗体、兔抗人Bax抗体、鼠抗人Bcl-2抗体、抗鼠二抗、抗兔二抗(Cell Signaling公司)；鼠抗人S6抗体、鼠抗人HIF-1α抗体、兔抗人β-actin抗体、荧光抗鼠二抗-AF488(Abcam公司)；凋亡检测试剂盒(天津三箭生物公司)；流式细胞仪(BD公司)；细胞培养箱和缺氧培养箱(Thermo Fisher Scientific公司)。

1.2 实验方法本实验在南阳医学高等专科学校实验室独立完成。

1.2.1细胞培养 复苏人骨肉瘤MG63细胞，10%胎牛血清RPMI1640培养基在5% CO2、37 ℃恒温培养箱中传代培养，待细胞融合率达80%时收集细胞。培养基重悬细胞，按1×105/ml浓度接种到6孔板中继续培养。

1.2.2流式仪检测细胞凋亡 将1.2.1中培养的细胞接种到6孔板后，分为常氧组、缺氧组(在2% O2，95% N2的缺氧培养箱中培养)和缺氧+雷帕霉素组。孵育24 h后，缺氧+雷帕霉素组加入0.1 nmol/L雷帕霉素，其余两组加入等量雷帕霉素的溶剂二甲基亚砜(DMSO)，继续孵育48 h。收集人骨肉瘤MG63细胞至离心管中，磷酸盐缓冲液(PBS)洗涤后离心。倒去上层液再加入PBS均匀混合，使用凋亡试剂盒，加入1×Binding Buffer使细胞浓度为1 × 106/ml，取100 μl加入EP管中，再加入5 μl FITC-Annexin V以及10 μl PI，室温下避光15 min，最后加入400 μl 1×Binding Buffer。

1.2.3细胞免疫荧光检测HIF-1α蛋白表达 人骨肉瘤MG63细胞融合率达80%时，用0.25%胰蛋白酶消化后收集于15 ml离心管中，800 r/min离心5 min。沉淀用含10%胎牛血清的RPMI1640培养基重悬，然后将少量细胞混悬液加入中心带有玻片的6孔培养板中，分为常氧组、缺氧组和缺氧+雷帕霉素组。处理72 h，细胞生长到约60%密度，弃去上清液，PBS浸洗玻片3次，2%多聚甲醛固定细胞15 min，PBS浸洗3次，0.5% Triton X-100的PBS室温通透20 min，PBS浸洗3次，吸水纸吸干。再滴加正常山羊血清，室温封闭30 min，依次加HIF-1α(1 ∶100)一抗和对应的荧光二抗(1 ∶200)。孵育结束后，4′,6-二脒基-2-苯基吲哚(DAPI)染核，然后在激光共聚焦显微镜下观察采集图像。

1.2.4si-RNA干扰技术沉默TSC1和HIF-1α的表达 ① 沉默TSC1、HIF-1α：选择生长状态良好的人骨肉瘤MG63细胞传代至6孔培养皿中，缺氧条件下进行过夜培养。待细胞处于对数生长期，细胞融合密度达60%～70%时，采用si-RNA转染试剂盒进行转染。转染4 h后加入含10%胎牛血清的RPMI1640培养基继续培养至48 h，然后放入缺氧培养箱(含2% O2，95% N2)中继续培养24 h，立刻提取细胞总蛋白做后续检测。si-RNA序列：TSC1：CCA AAUCUCAGCCCGCUUUTT；HIF-1α：GCCUCUGAUA AAGGCAACUTT，设置阴性对照组。实验分为阴性对照组(NC组)、沉默TSC1组(si-TSC1组)、沉默HIF-1α组(si-HIF-1α组)和同时沉默TSC1/ HIF-1α组(si-TSC1+HIF-1α组)。② 过表达HIF-1α：按照文献[9]，构建HIF-1α基因的慢病毒过表达载体质粒，慢病毒法感染MG63细胞并筛选得到HIF-1α过表达的MG63细胞。HIF-1α基因序列：上游:3′-GA GGATCCCCGGGTACCGGTCGCCACCATGGAGGGCG CCGGCGGCGCGAACGA-5′；下游:3′-TCACCATGGT GGCGACCGGGTTAACTTGATCCAAAGCTCTG-5′，序列中斜体加粗处为表达增强序列，下划线处为 Age I酶切位点。将未导入HIF-1α基因序列的空质粒组作为空载体组，实验分为空载体组、雷帕霉素+空载体组和雷帕霉素+过表达HIF-1α组。

1.2.5Western blot检测蛋白表达 人骨肉瘤MG63细胞融合率达90%后收集并裂解细胞，提取总蛋白，并用BCA试剂盒检测蛋白浓度；按照不同样品蛋白浓度取不同体积的蛋白样品(总质量30 μg)，经10% SDS-PAGE电泳分离；转移至硝酸纤维素膜上，5%脱脂奶粉的TBS-T封闭；加入TSC1(1 ∶2 000)、p-S6(1 ∶3 000)、S6(1 ∶4 000)、HIF-1α(1 ∶2 000)、Bax(1 ∶2 000)、Bcl-2(1 ∶3 000)等Ⅰ抗及辣根过氧化物酶(HRP)标记Ⅱ抗，采用ECL法曝光显影。

2 结果

2.1 雷帕霉素在缺氧条件下对人骨

肉瘤MG63细胞凋亡的影响流式仪检测各组细胞凋亡率：常氧组为5.22%～6.78%(6.00%±0.78%)；缺氧组为4.64%～5.62%(5.13%±1.33%)；缺氧+雷帕霉素组为16.34%～19.00%(17.67%±0.49%)。与常氧组、缺氧组比较，缺氧+雷帕霉素组细胞凋亡率显著增加(P<0.001)；常氧组与缺氧组细胞凋亡率比较差异无统计学意义(P>0.05)。见图1。

2.2 雷帕霉素在缺氧条件下对人骨肉瘤MG63细胞mTORC1活性的影响Western blot检测细胞mTORC1活性指示蛋白p-S6蛋白的表达。与常氧组比较，缺氧组细胞p-S6蛋白表达显著上调，但缺氧+雷帕霉素组细胞p-S6蛋白表达显著下调。见图2。

2.3 雷帕霉素在缺氧条件下对人骨肉瘤MG63细胞HIF-1α表达的影响免疫荧光检测细胞HIF-1α表达的结果显示：与常氧组比较，缺氧组细胞HIF-1α表达显著上调，且向核内转移；与缺氧组相比，缺氧+雷帕霉素组细胞HIF-1α表达显著下调。见图3。

2.4 雷帕霉素在缺氧条件下通过mTORC1/HIF-1α信号通路对人骨肉瘤MG63细胞凋亡相关蛋白的影响构建过表达HIF-1α的质粒，转染人骨肉瘤MG63细胞的结果显示：与空载体组比较，过表达HIF-1α组HIF-1α蛋白表达显著增加，见图4A。缺氧条件下，与空载体组比较，雷帕霉素+空载体组细胞HIF-1α表达显著下调，促凋亡蛋白Bax表达增加，抗凋亡蛋白Bcl-2表达下调；与雷帕霉素+空载体组比较，雷帕霉素+过表达HIF-1α组细胞HIF-1α表达上调，同时Bax表达下降，Bcl-2表达上调，见图4B。

用si-RNA方法分别沉默TSC1(mTORC1活化)和HIF-1α来证明mTORC1是否调节HIF-1α达到调控人骨肉瘤MG63细胞凋亡的目的。与NC组比较，si-TSC1组细胞mTORC1激活(p-S6蛋白表达上调)，HIF-1α蛋白表达增加，Bax蛋白表达下调，而Bcl-2蛋白表达上调；与NC组比较，si-HIF-1α组细胞mTORC1活性无显著变化，Bax蛋白表达上调，Bcl-2蛋白表达下调；与NC组比较，si-TSC1+HIF-1α组细胞mTORC1活性增强，但HIF-1α蛋白表达降低，Bax蛋白表达上调，Bcl-2蛋白表达下调，见图4C。

3 讨论

骨肉瘤是起源于间叶组织的恶性肿瘤，恶性程度高、转移早，是儿童和青少年最常见的原发性恶性肿瘤。尽管可通过手术、放疗、化疗等方法治疗骨肉瘤，但是其5年生存率仍然不足20%[1-2]。哺乳动物mTOR是细胞内重要的信号传导途径，在细胞增殖和凋亡过程中发挥关键性作用[2]。本研究以体外培养人骨肉瘤MG63细胞为模型，并模拟肿瘤细胞缺氧环境，诱导细胞HIF-1α表达，证明缺氧环境下人骨肉瘤MG63细胞过表达HIF-1α可能是细胞存活的重要保障。缺氧条件下人骨肉瘤MG63细胞mTORC1上调能够促进细胞存活，而mTORC1特异性抑制剂雷帕霉素能够显著上调细胞的凋亡率，这主要是因为雷帕霉素抑制mTORC1/HIF-1α信号通路，促使人骨肉瘤MG63细胞促凋亡蛋白Bax表达增多，同时抗凋亡蛋白Bcl-2表达减少。因此，雷帕霉素对体外培养的人骨肉瘤MG63细胞的促凋亡作用依赖mTORC1/HIF-1α信号通路。

3.1 雷帕霉素促进人骨肉瘤细胞凋亡与mTORC1活性降低有关mTOR复合物有2种不同的存在形式：mTORC1和mTORC2，它们分别接受相应的上游信号，参与调节不同的生物学过程。mTORC1活性参与实体肿瘤的增殖和侵袭，mTORC1活性抑制剂促进肿瘤细胞凋亡，抑制肿瘤侵袭[10-11]。但是在实体肿瘤内，mTORC1活性呈现不均一性，使得mTORC1活性抑制剂的抗肿瘤作用减弱[11]。人骨肉瘤组织mTORC1过度活化是导致骨肉瘤细胞耐药的一个很重要原因，mTORC1特异性抑制剂雷帕霉素能够增加骨肉瘤细胞对化疗药物的敏感性，抑制细胞增殖和促进细胞凋亡[12]。由于骨肉瘤组织内部常处于缺氧状态[6]，本研究通过体外培养人骨肉瘤MG63细胞并模拟缺氧环境，用0.1 nmol/L雷帕霉素刺激人骨肉瘤MG63细胞发现，细胞凋亡率明显增加。这说明雷帕霉素抑制人骨肉瘤MG63细胞存活。另外，本研究证实缺氧会诱导人骨肉瘤MG63细胞mTORC1活性(p-S6蛋白表达)增加，但是与常氧组细胞相比，缺氧组细胞凋亡率未发生显著改变，这说明缺氧不会影响人骨肉瘤MG63细胞在体外环境中的存活；接下来又在缺氧条件下给予人骨肉瘤MG63细胞雷帕霉素处理，发现人骨肉瘤MG63细胞mTORC1活性明显抑制。这与以往的文献报道结果[3-4]一致。说明雷帕霉素可能通过抑制缺氧条件下的人骨肉瘤MG63细胞的mTORC1活性而促进骨肉瘤细胞凋亡。

3.2 雷帕霉素促进人骨肉瘤细胞凋亡依赖mTORC1/HIF-1α信号通路缺氧微环境为实体肿瘤的恶性增殖和侵袭提供了很好的保障，缺氧诱导肿瘤组织过表达HIF-1α，促进其合成分泌血管内皮生长因子，进而激活血管化，增加肿瘤细胞对化疗药物的抵抗[5]。本研究发现缺氧环境下人骨肉瘤MG63细胞高表达HIF-1α，并向核内转移，促进抗凋亡蛋白Bcl-2表达，同时抑制促凋亡蛋白Bax表达，提示高表达HIF-1α可能有利于人骨肉瘤MG63细胞在缺氧环境下存活。有文献报道肾癌细胞中活化的mTORC1促进HIF-1α过表达，进而抑制p-53蛋白调控的细胞凋亡过程[13]。二甲双胍通过抑制mTORC1/HIF-1α信号调控CD19+白血病进展[14]。我们猜测雷帕霉素在缺氧条件下诱导人骨肉瘤MG63细胞凋亡可能与mTORC1/HIF-1α信号活性改变有关。

本研究结果表明，雷帕霉素显著下调缺氧条件下人骨肉瘤MG63细胞的HIF-1α蛋白表达，这与抑制mTORC1活性的结果并行，提示mTORC1和HIF-1α是调控人骨肉瘤MG63细胞存活的重要分子。进一步研究发现，当上调人骨肉瘤MG63细胞mTORC1活性时，HIF-1α表达上调，发挥抑制细胞凋亡作用；当下调人骨肉瘤MG63细胞HIF-1α表达时，细胞mTORC1活性不受影响，但促进细胞凋亡活性；当同时下调人骨肉瘤MG63细胞HIF-1α表达和激活mTORC1信号时，细胞依然保持较高水平的凋亡活性。这些结果表明，mTORC1调控人骨肉瘤MG63细胞凋亡是通过HIF-1α信号实现的。HIF-1α可增加细胞对缺氧环境的适应性，实体肿瘤内部不可避免的存在缺氧环境，正是因为肿瘤细胞高表达HIF-1α，进而发挥其核内转录调控作用，最终促进肿瘤细胞增殖和迁移。而mTOR能够调控缺氧条件下HIF-1α以及其下游靶基因的表达，敲除mTOR或者mTOR抑制剂能够抑制HIF-1α表达，显著减缓肿瘤细胞增殖[15]。我们在体外模型中证实人骨肉瘤MG63细胞存活依赖mTORC1/HIF-1α信号激活，雷帕霉素通过抑制mTORC1/HIF-1α信号从而促进人骨肉瘤MG63细胞凋亡，说明mTORC1/HIF-1α可能是骨肉瘤治疗的新靶点。

综上所述，缺氧条件下雷帕霉素能够促进人骨肉瘤MG63细胞凋亡，模拟实体肿瘤组织内部缺氧环境，证实雷帕霉素可能通过调控mTORC1/HIF-1α信号促进人骨肉瘤MG63细胞凋亡。虽然本研究无体内实验数据进一步证实，但是这一结论为进一步研究人骨肉瘤细胞的耐药机制提供了新的理论依据，也为临床治疗骨肉瘤提供新的作用靶点。