富血小板血浆改善卵巢功能及体外受精结局的作用机制

唐曼红，王玉霞 ，严玥，洪成浩

(暨南大学附属第一医院，广东 广州)

0 引言

富血小板血浆(PRP)是含有超过生理浓度5-10倍血小板的血浆，主要通过释放细胞因子和生长因子发挥修复作用。这一作用的理论支持基于组织损伤的自然修复过程，机体发生损伤后将第一时间招募血小板，募集后的血小板释放各种活性物质吸引干细胞完成组织的自我修复[1]。PRP疗法作为一种新型的临床治疗模式已被广泛应用于以整形美容科、骨关节科、皮肤科为主的各大科室。

随着人类对病因学的深入探究，PRP在维持女性生殖能力中的作用得到诸多关注。通过促进原始卵泡发育、修复子宫内膜等机理，PRP在治疗以卵巢、子宫因素为主的不孕症中的作用得以显现。目前，辅助生殖技术(ART)对于常规治疗无效的不孕症患者具有相对普适性，PRP的出现既能从根本上提高不孕症患者的生殖潜能，又能为ART的开展提供有力的环境支持，从而提高妊娠率及活产率，具有一定的临床应用价值。本文就PRP对于改善卵巢功能及IVF结局的作用机制进行综述。

1 PRP的生物学特征与临床应用

1.1 制备与分类

抽取自体或供体全血通过数次离心得到由红细胞和血小板组成的软颗粒，将其均质化后形成PRP。每30mL的静脉血大约可提取3-5mL的PRP制剂，并可根据制备方法、样品含量及应用范围等对其进行分类。多学科共识委员会基于细胞因子含量与纤维蛋白密度将PRP制剂分为四种类型：纯富血小板血浆(P-PRP)、富白细胞和血小板血浆(L-PRP)、纯富血小板纤维蛋白(P-PRF)、富白细胞和血小板的纤维蛋白(LPRF)[2]。

1.2 组成与活化

高浓度的细胞因子和生长因子是PRP制剂主要的生物学特征，包括血小板衍生生长因子(PDGF)、胰岛素样生长因子(IGF)、血管内皮生长因子(VEGF)、表皮生长因子(EGF)、成纤维细胞生长因子(FGF)、转化生长因子-β(TGF-β)、结缔组织生长因子(CTGF)等，这些活性物质可在PRP经凝血酶、氯化钙、胶原蛋白等激活后于局部损伤部位大量释放或进入循环系统，及时参与受损组织的修复过程[3]。血小板促进伤口愈合的另一重要机制是其自身存在支持再生基质的纤维蛋白框架，能迅速建立适当的组织形态和分子构型。

1.3 临床应用

近十年来，PRP因其普遍适用及高效性已在临床上被广泛应用于相关疾病的防治。一方面，头皮下注射自体PRP制剂在促进头皮组织生长的同时也改善毛囊环境，增加毛发密度，因而被应用于雄激素性脱发[4]。另一方面，PRP可刺激成纤维细胞的活化并促进胶原蛋白及透明质酸的合成，为皮肤再生学提供坚实的理论基础[5]。此外，因其具有缓解角膜充血、降低眼渗透压的作用，PRP常用来改善分泌性干眼症患者的视力[6]。同时，对于退行性骨关节炎患者，PRP除了能促进软骨细胞基质的合成，还可抑制炎症的发生[7]。基于PRP在组织损伤愈合的过程中发挥的作用，近几年来，学者们对其在女性生殖系统疾病的作用进行了探索与研究，发现PRP不仅能改善女性的卵巢功能，还能提高不孕症患者接受体外受精周期的成功率。

2 PRP改善卵巢功能的分子机制

2.1 TGF-β联合多种细胞因子预防卵巢衰竭

卵巢衰竭主要表现为甾体激素缺乏、排卵障碍、闭锁卵泡数量增加，PRP主要通过刺激卵泡发育、促进排卵、减少卵泡闭锁及抑制卵巢组织凋亡来预防卵巢衰竭。

PRP富含的血小板α颗粒激活后释放的TGF-β，包括骨形成发生蛋白15(BMP-15)及生长分化因子9(GDF-9)，在早期已被证实为卵母细胞的特异生长因子[8]。BMP-15及GDF-9对卵母细胞的作用主要通过影响卵巢颗粒细胞(GC)的发育实现，二者通过激活GC的跨膜丝氨酸/苏氨酸激酶受体调控SMAD蛋白，通过与SMAD的相互作用将信号传导给细胞核，再与特定的转录因子作用，调节靶基因的转录和翻译，经双向信号调控(卵母细胞-颗粒细胞调控环)最终促进卵母细胞的发育、增殖及分化[9]。并且BMP-15、GDF-9之间存在协同作用，BMP-15/GDF-9异二聚体(累积蛋白)可直接与GCs相应受体结合，激活SMAD2/3、SMAD1/5/8信号通路，导致下游基因的级联反应，促进与卵母细胞调节的GCs分化相关基因的增殖与表达，以此改善卵母细胞的质量。其次，二者可通过细胞间的缝隙连接利用胆固醇合成途径的产物来滋养卵母细胞。再次，BMP-15还可抑制类固醇急性调节蛋白的表达减少黄体酮的产生，从而抑制卵泡黄素化。另外，BMP-15、GDF-9可激活卵丘细胞中有丝分裂原激活蛋白激酶(MAPK)，恢复卵母细胞的减数分裂。GDF-9还可刺激透明质酸合成酶-2、前列腺素合成酶-2的表达，促进卵丘扩张并发生排卵[10,11]。

除 TGF-β外，PRP释放的 PDGF、VEGF、EGF、CTGF、IGF-1也参与了改善卵巢功能的过程。PDGF、IGF-1通过酪氨酸激酶受体通路介导，触发DNA合成和细胞周期特异性原癌基因fos和myc，使卵母细胞在24小时内进入有丝分裂[12]。c-myc可促进卵巢组织凋亡，在闭锁卵泡中大量表达，Samira Seyyed Anvari 在研究PRP与PCOS的相关作用时检测到经PRP治疗后的PCOS小鼠c-myc表达显著降低，闭锁卵泡的数量也明显减少[13]。VEGF则负责卵泡膜细胞及GC之间的血管网络，为卵泡发育提供营养物质[14]。卵母细胞需要依赖EGF网络介导的卵丘细胞信号调节成熟过程中的mRNA翻译，FSH调节卵母细胞翻译也是通过EGFR介导[15]，而且EGF样肽参与调节卵丘细胞内糖酵解和卵母细胞内氧化磷酸化过程，由此促进卵母细胞的成熟[16]。CTGF与TGF-β、WNT和MAPK通路相互作用，是细胞黏附、迁移、增殖及分化过程的重要调节因子[17]。综上，PRP主要通过刺激卵泡发育、促进排卵、减少卵泡闭锁及抑制卵巢组织凋亡来预防卵巢衰竭。

2.2 VEGF、PDGF调控卵巢血供及氧化应激反应

PRP通过增加卵巢组织的血液灌注、抑制卵巢组织的氧化应激反应减少卵巢组织在缺血-再灌注过程中产生的细胞坏死及凋亡，这一过程主要由PRP释放的活性因子VEGF及PDGF发挥作用。

首先，PRP可增加卵巢缺血组织的血液灌注。卵巢扭转过程中会导致动静脉管腔阻塞、坏死，持续的缺血缺氧会导致卵巢发生不可逆的组织损伤。VEGF、PDGF及TGF-β1在早期已被证实可促进细胞增殖分化和血管生成。其中，VEGF是一种血管生成肽，能减轻多种器官的缺血-再灌注损伤，它不仅可引起血管内皮细胞的分化和迁移，还可通过释放PDGF-BB促进血管壁细胞的积累，并且能将造血干细胞从骨髓募集到缺血部位，这些干细胞分化成毛细血管丛，最终形成成熟的血管，从而增加卵巢缺血组织的血液灌注。Shyamal Chandra Bir在研究PRP的血管生成特性时发现PRP处理组小鼠离体后肢的血管内皮细胞分化、血管密度及血液灌注状态均明显优于对照组[18]。Murat Bakacak 在研究PRP对大鼠卵巢缺血再灌注损伤的保护作用时也观察到PRP处理组的腹膜VEGF浓度明显高于对照组，并且PRP处理组的卵巢出血、间质水肿的情况也得到显著改善[19]。因此，PRP可通过增加卵巢组织的血管生成与血液灌注来减轻其缺血-再灌注损伤。

其次，PRP可抑制卵巢组织的氧化应激反应。在缺血-再灌注过程中，组织产生大量的活性氧(ROS)、促炎细胞因子、细胞黏附分子，这些物质的大量生成会超过卵巢组织自身的抗氧化能力，引起细胞和线粒体膜的破坏，导致细胞凋亡及坏死[20]。缺血时中性粒细胞聚集导致ROS增多从而进一步加重组织损伤，由PRP释放的VEGF可抑制缺血-再灌注组织中性粒细胞的浸润，减少ROS的产生，并刺激抗凋亡因子mRNA的表达，促进生殖细胞的存活[21]。同时，PDGF还可通过激活核因子E2相关因子2—抗氧化反应原件信号来防止氧化损伤[22]。另外，PRP还可作为细胞凋亡的调节信使，通过抑制ASK-1和pNF-κB的表达降低活性氧和促炎细胞因子的水平。实验观察到，经PRP处理后的大鼠卵巢组织氧化应激指数(OSI)及平均总氧化状态(TOS)均明显低于对照组[13,19]。由此可见，PRP可通过抑制卵巢组织的氧化应激反应来减轻其缺血-再灌注损伤。

3 PRP提高体外受精成功率的潜在机制

3.1 通过改善子宫内膜容受性降低RIF率

RIF是指接受IVF周期的不孕症妇女至少连续三次优质胚胎植入失败[23]。胚胎植入与着床与子宫内膜容受性有关，子宫内膜容受性低下是导致RIF的主要原因之一。PRP可通过改善子宫内膜条件及抑制子宫内膜炎症来提高子宫内膜容受性，从而降低RIF率。

首先，PRP分泌的生长因子及细胞因子通过细胞旁分泌作用，刺激子宫内膜基质细胞迁移、增殖、分化，从而诱导子宫内膜组织再生，增加子宫内膜厚度。经宫腔灌注PRP治疗后，难治性薄型子宫内膜患者的内膜厚度普遍可达7mm以上[24-26]。其次，PRP增加与子宫内膜血管增殖相关的SUSD、CD105、CD146的表达，改善血管分布[27]，这不仅为胚胎着床创造了优良的土壤条件，同时为胚胎发育提供了丰富的营养物质。另外，PRP还可激活Hippo信号通路，下调CTGF并上调WNT5a与GDF-5的表达。CTGF是TGF-β对成纤维细胞作用的下游介质，其表达减少有助于抑制子宫内膜纤维化，形成正常的子宫内膜结构。WNT5a的表达子宫内膜腺体发育有关，在体外可促进人类胚胎干细胞分化为子宫内膜样细胞，而GDF-5参与子宫内膜蜕膜化，对胚胎着床至关重要[28]。有体外证据表明，短期PRP刺激可激活Akt信号转导及转录因子3(STST-3)途径的磷酸化，上调FOXo1、LIF、IL1-β的表达，这些活性物质均为子宫内膜容受性的标志物[27]，尤其LIF介导了滋养细胞与子宫内膜细胞的黏附，可增加子宫内膜容受性，促进胚胎着床[29]。

胚胎植入是炎症和抗炎平衡的结果，这些机制的不平衡将会导致RIF。在胚胎植入过程中，子宫内膜上皮细胞和基质细胞对植入前胚胎产生的HCG产生反应，合成IFNG、IL-1B、IL-6、IL-8、PDGF、TNF、VEGF等活性因子，这些因子起局部作用并影响炎症、侵袭、分化、增殖和细胞粘附等过程。PRP活化后不仅可释放TNF、PDGF、VEGF等生长因子，还可释放三种抗炎因子(IL-4、IL-13、IFN-a)及三种促炎因子(IL-8、IL-17、TNF-a)，这些炎症介质相互作用，维持母胎平衡。宫腔输注PRP后检测到子宫内膜组织中IL-1β、IL-4、IL-10表达增加，IL-6表达减少[27]，故PRP改善子宫内膜容受性的另一个可能机制是影响母胎界面的炎症反应。临床上，Sfakianoudis K利用PRP疗法协助慢性子宫内膜炎患者实现有效的IVF周期并成功妊娠[30]。因此，PRP可通过调节子宫内膜容受性降低RIF率。

3.2 通过增加卵巢储备提高卵巢反应性

卵巢储备低下可降低卵巢对促性腺激素的反应，导致可利用的卵母细胞和胚胎数量减少，最终降低IVF成功率。PRP富含的生长因子与细胞因子参与组织再生和愈合的过程，不仅可促进卵母细胞的发育，还可提高卵巢对促性腺激素的亲和力，由此改善卵巢在IVF周期中的反应性。

PDGF广泛存在于卵母细胞和颗粒细胞中，并起到激活原始卵泡的作用；GDF-9对卵泡生长的所有阶段均有效，可增加原始卵泡与腔前卵泡的数量。此外，在卵泡发育期间，血管内皮生长因子(VEGF)可促进卵巢形成新的血管，卵泡血流量的增加丰富了氧气和营养物质，并且可通过诱导内皮细胞中抗凋亡蛋白的表达来预防滤泡闭锁，由此增强了其对促性腺激素的反应能力[31]。而且，血流的改善可诱导卵巢干细胞的分化，从而发育出新的卵母细胞并促进卵巢再生[32]。Marzie Farimani在卵巢反应不良的女性卵巢内注射PRP后观察到，PRP注射后卵母细胞的平均数量明显多于注射前，并首次报道了卵巢反应不良患者在经PRP治疗后的三例活产[33]。故PRP可通过增加卵巢储备并增强其对促性腺激素的反应能力来提高卵巢反应性。

4 结语

本文总结了PRP在改善女性卵巢功能及IVF结局中所发挥的潜在作用机制。尽管PRP在女性生殖系统疾病中表现出良好的应用前景，但迄今为止，关于PRP是否广泛应用于妇产科相关疾病的防治仍存在诸多争议。PRP的优越性在于取材便捷、制作成本较低，因其可来源于自体血浆，故可避免发生疾病播散及免疫排斥反应，且目前在临床应用过程中尚未发现与其相关的不良反应。而它的局限性在于至今并未形成统一的制作及最佳应用浓度标准，且许多作用机制仍不明确，因此尚需大量的临床实验来证实它的疗效。