空气颗粒物和香烟烟雾提取物对人气道上皮及巨噬细胞的影响

2020-12-28于涛崔晗崔烨刘杰吕喆孙英王炜杨汀

国际呼吸杂志 2020年24期

于涛崔晗崔烨刘杰吕喆孙英王炜杨汀

1中日友好医院呼吸与危重症医学科国家呼吸疾病临床医学研究中心中国医学科学院呼吸病学研究所,北京100029;2中国医学科学院北京协和医学院基础医学研究所生理学系100005;3首都医科大学基础医学院免疫学系,北京100069

通信作者:杨汀,Email:dryangting@qq.com

COPD 是一种常见的慢性疾病,其主要特征为持续的呼吸道症状和气流受限,进而引起气道和/或肺泡异常,其发病机制尚未明确,通常认为与暴露于毒性颗粒和气体有关。近年来,愈加严重的空气污染已成为COPD 发生发展的一个重要的因素。空气颗粒物 (particulate matter,PM),尤其是粒子直径≤2.5μm 的颗粒物 (PM2.5),是空气污染物中主要的致病成分。流行病学研究表明,吸烟人群较不吸烟人群更易受空气污染的影响[1]。PM2.5可沉积于肺泡,导致气道免疫应答紊乱,促进肺部炎症产生。由此可见,PM 和吸烟与COPD 的发生发展关系密切,但有关二者共同作用机制的研究较少。

气道上皮细胞和肺泡巨噬细胞是气道抵抗外来致病物质的主要屏障。研究表明,香烟烟雾刺激和PM 均可破坏气道上皮细胞的应答反应,增加感染的风险[2]。巨噬细胞在COPD 中同样具有重要作用。在COPD 患者的气道内,巨噬细胞的数量较正常人增加5～10倍,且其数量和肺气肿严重程度相关[3]。同时,PM 刺激可使巨噬细胞分泌大量促炎因子,诱导局部发生炎症反应[4-5]。尽管有研究表明香烟烟雾和PM 对气道上皮细胞和巨噬细胞的功能均有不同影响,但在相互作用方面尚需进一步探索。鉴于此,本研究通过体外实验探索PM 及香烟烟雾提取物(cigarette-smoke extract,CSE)对上皮细胞和巨噬细胞功能的影响。

1 材料与方法

1.1 细胞人肺泡上皮细胞系A549细胞、人单核细胞系THP-1细胞购于美国菌种保藏中心。

1.2 主要试剂及仪器 DMEM 高糖培养基、RPMI 1640培养基、青-链霉素和磷酸盐缓冲液购于美国Hyclone公司;胎牛血清购于美国Gibco公司;佛波酯购于美国Sigma公司;PM 为标准参考材料1649b,购于美国国家标准与技术研究院;二甲基亚砜购于美国Sigma公司;CCK-8 试剂购于日本同仁化学研究所;Annexin Ⅴ/PI凋亡试剂购于北京四正柏生物科技有限公司;细胞因子酶联免疫吸附试验试剂盒购于美国Invitrogen 公司;Occludin抗体、ZO-1抗体购于美国Invitrogen公司;Claudin购于美国Abcam 公司;Trizol试剂购于美国Life Technologies公司;荧光二抗购于美国LI-COR 公司。NanoDrop 2000分光光度计、细胞培养箱和生物安全柜购于美国Thermo Fisher Scientific公司;ABI PRISM 7500 PCR 仪器购于美国Applied Biosystems 公司;流式细胞仪BD LSRFortessaTM购于美国BD Biosciences公司;全波长光吸收酶标仪购自Perkin Elmer 公司;Odyssey红外成像系统购自美国LI-COR 公司。

1.3 方法

1.3.1 PM 混悬液制备在生物安全柜无菌环境下称取PM 标准品200 mg,溶解于1 ml无菌二甲基亚砜中 (作用终浓度为0.1%,一般认为二甲基亚砜≤0.1% 时,不引起细胞生物学性状的改变[6]),持续超声粉碎3 min,分装后4 ℃保存,每次使用前超声3 min。标准参考材料1649b由城市尘埃组成,包括多环芳香烃、硝基多环芳香烃、多氯联苯同源物、农药和二恶英等[7]。

1.3.2 细胞培养 A549细胞用含10%胎牛血清和1%青-链霉素的DMEM 培养基,置于37℃、5%CO2孵箱中常规培养。THP-1细胞用含10%胎牛血清和1%青-链霉素的RPMI 1640 培养基,置于37 ℃、5%CO2孵箱中常规培养。

1.3.3 CSE制备按之前研究描述的方法[8]制备CSE。使用吸烟机将1根香烟(所用香烟为 “万宝路”,含焦油量10 mg,烟气烟碱量0.8 mg,烟气一氧化碳量11 mg)的烟气吸入10 ml无菌培养基。用0.22μm 滤器过滤制备成100%CSE,于制备后30 min内立即使用。

1.3.4 CCK-8法检测细胞增殖将A549细胞按5×104/ml的浓度接种至96孔板。将THP-1细胞按5×105/ml的浓度接种至96孔板,加入100μg/L佛波酯诱导分化为THP-1 源性巨噬细胞样细胞。24 h后,弃掉培养基,更换为无血清培养基饥饿12 h,加入不同浓度的PM (25、50、100、200 mg/L )、 CSE (0.2%、 0.5%、 1.0%、2.0%、5.0%)、PM (50 mg/L)+CSE (0.5%)刺激24 h后,向各孔加入10μl CCK-8试剂,在37 ℃、5%CO2孵箱中孵育4 h。用自动酶标仪在450 nm 波长处测定吸光度,细胞增殖活力=吸光度处理组/吸光度空白对照组。

1.3.5 Annexin Ⅴ/PI双标记检测细胞凋亡将A549细胞按5×104/ml的浓度接种至24孔板。将THP-1细胞按2×105/ml的浓度接种至24孔板,加入佛波酯诱导分化为THP-1 源性巨噬细胞样细胞。24 h后,弃掉培养基,更换为无血清培养基饥饿12 h,加入上述同样刺激物刺激24 h后,收集细胞于1.5 ml离心管内,离心后弃上清加入1×Annexin ⅤBinging Buffer重悬细胞。取100μl于新管内,加入5μl Annexin Ⅴ/Alexa Flour 488室温避光孵育5 min后,加入10μl PI和400μl磷酸盐缓冲液,进行流式检测。

1.3.6 酶联免疫吸附试验检测细胞因子浓度将A549细胞和THP-1细胞接种至24孔板,按1.3.4方法,加入上述刺激物刺激24 h后,收集细胞上清,按照试剂盒说明检测上清中IL-6、IL-8、IL-1β的浓度。

1.3.7 实时聚合酶链式反应检测巨噬细胞极化标志物将THP-1细胞按2×106/ml接种至6孔板,加入PM (50 mg/L)、CSE (0.5%)或PM(50 mg/L)+CSE (0.5%)24 h后,弃上清,用Trizol提取细胞总RNA,分光光度计测定其浓度和纯度后,将总RNA 逆转录为cDNA,于ABI PRISM 7500仪器上实施实时聚合酶链式反应检测CD163 mRNA 和CD80 m RNA 的表达水平。引物设计及购买由美国Invitrogen公司提供。以β-actin为内参,采用2-ΔΔCT法分析基因转录水平。引物序列见表1。

1.3.8 免疫印迹法检测紧密连接蛋白表达将A549细胞以105/ml接种至6 cm 培养皿,加入上述刺激物24 h 后,弃上清,提取细胞总蛋白,用BCA 法测定蛋白浓度。行10%SDS-PAGE凝胶电泳,湿法转膜。5%脱脂奶粉室温封闭1 h,ZO-1一抗(1∶500)、occludin一抗 (1∶100)、claudin一抗(1∶200)、β-actin一抗 (1∶1 000)4 ℃孵育过夜。TBST (0.1% Tween20-TBS)洗3 次,每次10 min。孵育二抗 (1∶10 000)1 h,TBST洗3次后于LI-COR Odyssey红外荧光扫描成像。以ImageJ软件作灰度分析。

表1 实验所用引物列表

1.4 统计学分析实验重复3次,使用GraphPad Prism 7.0软件进行分析。所有数据均以x-±s 表示,2组之间采用t 检验进行比较分析,3个或多组间比较行单因素方差分析 (one-way ANOVA)。P ＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 PM 与CSE 对A549细胞活性的影响 A549细胞暴露于不同刺激物后,细胞活性如图1、2所示,PM 和CSE 刺激对细胞增殖均呈现出明显的抑制趋势,且呈浓度依赖关系。因PM 浓度在50 mg/L、CSE浓度在0.5%时出现显著差异,故确定该浓度为后续实验刺激浓度。同时,对刺激后的A549细胞进行凋亡检测,结果如图3、4所示,PM 和CSE均可诱导A549细胞发生早期凋亡,且呈现浓度依赖关系。将两者叠加刺激后,如图5、6所示,可见PM 和CSE 单独刺激对细胞活性有明显的影响,PM 与CSE 叠加较单独刺激组能够进一步加重对细胞活性的影响,促进细胞凋亡。

2.2 PM 与CSE 对A549细胞炎症因子分泌的影响如图7～10所示,暴露于不同浓度的CSE 均可刺激A549细胞产生IL-6 和IL-8;该细胞暴露于PM 24 h后上清中IL-6浓度明显升高,且呈浓度依赖关系,但随着PM 浓度的升高,A549细胞产生IL-8降低。两者叠加刺激后,如图11、12所示,PM 能够加重CSE 诱导的IL-6产生,且与单独暴露于PM 或CSE 组相比差异有统计学意义(P 值均＜0.01)。但是对于IL-8的产生,PM 与CSE叠加并无明显作用。

2.3 PM 与CSE 对A549细胞紧密连接蛋白的影响 A549细胞暴露于上述刺激24 h后,检测细胞中ZO-1、occludin、claudin 蛋白的表达。结果如图13所示,PM 主要影响occludin的表达,单独刺激与和CSE 叠加刺激均降低occludin表达,但对ZO-1和claudin未有显著影响。

图1 PM 对A549细胞增殖的影响

图2 CSE对A549细胞增殖的影响

2.4 PM 与CSE 对THP-1 细胞活性及炎症因子产生的影响 THP-1细胞暴露于上述刺激24 h后可见(图14、15),PM 对降低THP-1衍生的巨噬细胞活性及促进其凋亡的作用强于CSE 的作用,在此方面二者无明显叠加作用。PM 与CSE 单独或叠加均可刺激该细胞产生IL-1β,且PM 的作用亦强于CSE 的作用 (图16);但对于IL-8 而言,二者无明显叠加作用(图17)。

2.5 PM 与CSE 对THP-1 细胞极化的影响 THP-1细胞暴露于上述刺激8 h后发现,PM、CSE以及二者叠加对CD163 m RNA的表达差异无统计学意义 (图18),但PM 可以明显促进CD80 m RNA 的表达,且二者叠加可进一步促进其表达(图19)。

3 讨论

近年来,空气污染已成为导致COPD 发生发展的重要因素之一。流行病学研究表明,空气污染物水平增加会引起COPD 患者肺功能恶化以及发生COPD 急性加重[9]。同时有研究发现,小鼠暴露于PM 出现明显的巨噬细胞和中性粒细胞浸润,且肺功能有显著的下降[10]。但目前大部分研究集中在单独PM对机体的影响,关于PM与吸烟的叠加作用机制研究所知甚少。因此,本研究从PM 与CSE叠加对细胞增殖、凋亡、炎症因子产生以及细胞功能层面进行了探讨。

图3 PM 对A549细胞早期凋亡的影响 A:0 mg/L PM;B:25 mg/L PM;C:50 mg/L PM;D:100 mg/L PM;E:200 mg/L PM;F:柱状图

图4 CSE对A549细胞早期凋亡的影响 A:0.0%CSE;B:0.2% CSE;C:0.5% CSE;D:1.0% CSE;E:2.0% CSE;F:5.0%CSE;G:柱状图

图5 各组A549细胞相对增殖活力的比较

慢性气道及肺泡炎症反应是COPD 的主要病理特征[11],而促炎细胞因子IL-6是判断COPD 预后的生物标志物[12]。有研究表明,PM 能够结合细胞Toll样受体,进而激活核转录因子κB信号通路,导致下游细胞因子IL-6的产生[13]。此外,含有IL-1β的炎性小体是一种多蛋白信号复合物,受外界信号刺激后可导致中性粒细胞炎症,且在COPD 患者中表达增加[14]。本研究发现PM 与CSE叠加可进一步增加A549细胞及THP-1细胞产生IL-6和IL-1β,且二者协同刺激较单独刺激有明显的差异。由此可以推断,这2种刺激可能通过不同的信号通路发挥作用,进而导致促炎细胞因子IL-6、IL-1β产生增加,并促进中性粒细胞等炎症细胞的聚集,促进了COPD 的发生发展。

图6 各组A549细胞早期凋亡细胞百分比的比较

图7 CSE对A549细胞产生IL-6的影响

图8 CSE对A549细胞产生IL-8的影响

图9 PM 对A549细胞产生IL-6的影响

图10 PM 对A549细胞产生IL-8的影响

图11 各组A549细胞IL-6水平的比较

图12 各组A549细胞IL-8水平的比较

紧密连接和ZO 家族可将相邻的肺泡上皮细胞连接在一起,形成一种保护上皮下组织的屏障。有研究表明,PM10能够使occludin 表达降低,进而破坏气道完整性[2]。与该报道一致,本研究发现PM 和CSE 单独暴露均可降低occludin 表达,但二者叠加对该蛋白表达并未产生明显差异。因此二者协同对上皮连接的影响有待于进一步的研究。

图13 各组A549细胞紧密连接蛋白ZO-1、occludin、claudin表达的比较 A:电泳图;B:ZO-1的相对表达;C:occludin的相对表达;D:claudin的相对表达

图14 各组THP-1细胞相对增殖活力的比较

图15 各组THP-1细胞中凋亡细胞百分比的比较

图16 各组THP-1细胞中IL-1β的比较

已知巨噬细胞存在不同的表型,在不同的条件下向不同方向分化且具有不同的生物学功能。Byrne等[15]研究表明,暴露于空气污染物后M1型巨噬细胞分泌的细胞因子IL-12和干扰素γ增多。而Bauer等[16]发现将肺泡巨噬细胞与气道上皮细胞共培养,在臭氧刺激下,巨噬细胞可向M2型分化。本研究发现,PM 与CSE 叠加可以导致巨噬细胞CD80 m RNA 表达增多,且与CSE 单独刺激有明显差异,提示PM 在CSE 基础上,可能进一步刺激巨噬细胞向M1型分化,加重机体炎症反应的产生和肺部损伤。