GeneXpert MTB/RIF在快速诊断肺结核和检测利福平耐药中的临床应用价值

谢平 陈彩萍 白茹 何玉 赵晖 刘纯波 刘亮明

上海市松江区中心医院感染科201600

通信作者:刘亮明,Email:liuliangming@hotmail.com

肺结核是由结核分枝杆菌 (Mycobacterium tuberculosis,MTB)引起的慢性呼吸道传染性疾病,对全球人类健康构成严重威胁。根据WHO的数据,2018 年全球新发结核病1 000万例,145.1万例(其中25.1万例合并艾滋病毒感染)死亡[1]。我国是结核病负担最重的国家之一,近年来随着耐药结核的产生,控制肺结核的任务更加艰巨,因此早期诊断肺结核以控制传染源就显得十分重要。然而,目前早期肺结核诊断仍较为困难,尚缺乏特异性和敏感性均高的检测手段。常规的痰涂片法敏感性较低,且该方法不能区别结核与非结核分枝杆菌;细菌培养法阳性率稍高,但耗时较长(需1～3个月),均不能很好地满足临床上快速诊断的需要。因此,寻找快速、简便、准确的结核病诊断方法一直是临床工作者研究的重点。近年来,一 种 新 的 MTB 基 因 检 测 方 法——Gene Xpert MTB/RIF (简称Xpert)开始在临床上应用。该方法采用实时荧光定量核酸扩增技术,检测MTB及对利福平耐药情况,2 h即可出结果。从理论上说,该方法需要的样本量小,且敏感性和特异性均较高,因而在肺结核早期快速诊断中可能有较好的应用前景。本研究旨在比较Xpert法与痰涂片法和培养法之间的敏感性、特异性等临床数据,以探讨Xpert的临床应用价值。

1 对象与方法

1.1 研究对象 选取2018年1月至2019年3月上海市松江区中心医院感染科门诊疑似肺结核患者,共1 059例。其中男742 例,女317 例,年龄范围为16～89岁 (中位年龄35岁)。诊断临床肺结核患者398例 (其中确诊病例297例),非肺结核661例[其中非结核分枝杆菌 (nontuberculosis mycobacterium,NTM)肺病6 例]。疑似肺结核的纳入标准:咳嗽≥2周,发热或呼吸困难,有肺结核影像学特征(上叶尖后段及下叶背段斑片状或片状影、结节影、索条影及空洞等),有效的痰液样本(超过3 ml)。排除标准:不能提供有效的痰标本,不能随访及失访者,胸部影像学无任何临床活动性肺结核表现。临床肺结核诊断参照最新版肺结核诊断标准(WS288-2017)[2]:肺部影像表现符合活动性肺结核病变 (斑点状、片状浸润性渗出影、小叶中心结节影、 “树芽征”、空洞伴卫星灶等),并经鉴别诊断排除其他肺部疾病,同时符合下列项目之一者。(1)有结核病相关临床表现(发热、咳嗽咳痰、盗汗乏力等);(2)结核菌素皮肤试验中度或强阳性;(3)MTB抗体阳性;(4)γ-干扰素释放试验阳性;(5)经正规抗结核治疗后临床症状改善,胸部影像学显示病灶较前明显吸收。确诊病例诊断标准(“金标准”):痰MTB培养阳性并鉴定为MTB复合群。所有纳入病例均进行痰液检查,完成Xpert检测、涂片抗酸染色、细菌培养、菌种鉴定及药敏试验,且均门诊随访至少2个月,以对初始诊断进行评估。本研究已通过本院伦理委员会批准,患者均签署研究知情同意书。

1.2 研究方法

1.2.1 样本收集 患者第一次就诊时留取即时痰液3～5 ml,并嘱患者留取夜间痰、次日晨痰各3～5 ml,于次日上午送交。对不能自然咳痰患者行雾化诱导排痰。每份痰标本挑取脓性部分行涂片抗酸染色(共3张涂片),剩余痰标本挑取脓性部分混合后各取1 ml分别用于Xpert检测和痰培养。1.2.2 痰涂片检测 按照 《结核病诊断实验室检验规程》操作。抗酸杆菌涂片使用Ziehl-Neelsen染色方法。结果判读:镜检下查见抗酸分枝杆菌为阳性,未查见抗酸分枝杆菌为阴性。

1.2.3 Xpert检测 按照Xpert(美国Cepheid公司)操作说明书进行。简要操作步骤:取1 ml痰标本置于有螺旋盖的前处理管中,加入相当于痰标本2 倍体积的痰处理液。振荡20 s,室温静置15 min,使痰标本充分液化。打开反应盒,吸取2 ml处理后样品,由加样孔缓慢加入反应盒内。将反应盒放置到检测模块,仪器开始自动化检测。约2 h后即可读取结果。

1.2.4 痰培养 采用BACTEC MGIT960 培养基,按照BACTEC MGIT960 仪器操作说明书进行,将所有标本进行液体培养。仪器培养时间最长为42 d报告结果。

1.2.5 菌种鉴定 培养阳性痰标本送至上海市疾病预防控制中心进行菌种鉴定。菌种鉴定使用对硝基苯甲酸和噻吩-2-羧酸肼生长试验鉴别MTB 和NTM。

1.2.6 药敏试验 由上海市疾病预防控制中心进行药敏试验鉴定,采用罗氏培养基(比例法)对所有培养阳性标本进行一线抗结核药物(利福平、异烟肼、乙胺丁醇、链霉素)药敏检测。

1.3 统计学分析 建立Excel数据库收集数据,采用SPSS 19.0软件进行统计学分析。计数资料以例数或百分比表示,组间比较采用χ2检验。P ＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 3种方法检测阳性率的比较 1 059例疑似肺结核患者中,Xpert法、涂片法、液体培养法3种方法检测的阳性率分别为21.53% (228/1 059)、12.09% (128/1 059)、28.61% (303/1 059)。与涂片法相比,Xpert法检测的阳性率显著升高(χ2=33.77,P ＜0.01);与液体培养法相比,Xpert法检测阳性率显著下降(χ2=14.14,P ＜0.01)。见表1。

表1 3种方法对1 059例疑似肺结核患者的检测结果 (例)

2.2 临床诊断肺结核患者中3 种检测方法的比较 398例临床肺结核患者中,Xpert法、涂片法、液体培养法3 种方法的阳性率分别为57.29%(228/398)、30.65% (122/398)、74.62% (297/398)。与涂片法相比,Xpert法检测的阳性率显著升高(χ2=57.30,P ＜0.01);与液体培养法相比,Xpert法检测阳性率显著下降(χ2=26.64,P ＜0.01)。见表2。

表2 3种方法对398例临床肺结核患者的检测结果 (例)

2.3 Xpert法和涂片法在确诊肺结核患者中检测结果的比较 297例确诊肺结核患者中,Xpert法、涂片法2 种方法的阳性率分别为71.04% (211/297)、39.39% (117/297)。与涂片法相比,Xpert法检测的阳性率显著升高 (χ2=60.16,P ＜0.01)。见表3。

表3 Xpert法和涂片法在297例确诊肺结核患者中的检测结果 (例)

2.4 Xpert法在痰涂片阳性或痰培养阳性患者中的检测结果 在128例痰涂片阳性病例中,Xpert阳性117例,Xpert在痰涂片阳性患者中的阳性率为91.41%;在303 例痰培养阳性病例中,Xpert阳性211例,Xpert在痰培养阳性患者中的阳性率为69.64%。见表4。

2.5 Xpert法对确诊病例痰标本的检测结果 所有确诊病例中,痰涂片阳性117例,其中Xpert检测阳性115例,Xpert法对确诊痰涂片阳性患者的诊断符合率为98.29%;涂片漏诊 (确诊但痰涂片阴性)180例中,Xpert阳性96例,Xpert法对确诊痰涂片阴性患者的检出率为53.33% (96/180)。这表明,Xpert法对确诊痰涂片阳性患者的诊断符合率高,且能明显提高痰涂片阴性肺结核的检出率。见表5。

表4 Xpert法在痰涂片阳性或痰培养阳性患者中的检测结果 (例)

表5 Xpert法对297例确诊肺结核患者痰标本的检测结果 (例)

2.6 Xpert法对肺结核诊断的临床应用价值 在所有疑似病例中,以痰培养阳性及菌种鉴定为MTB为确诊标准,确诊肺结核297例,未确诊肺结核762 例 (其中临床肺结核101 例,非肺结核661例)。以肺结核确诊为金标准,Xpert法和涂片法诊断肺结核的敏感性分别为71.04% (211/297)、39.39% (117/297),特异性分别为97.77% (745/762)、98.56% (751/762)。与涂片法相比,Xpert法的敏感性显著升高 (χ2=60.16,P ＜0.01),2种方法的特异性差异无统计学意义(χ2=1.31,P ＞0.05)。在非肺结核患者 (661 例)中Xpert均为阴性,阴性率为100.00%;而Xpert阴性者中有86例确诊肺结核。以肺结核确诊为金标准,Xpert法诊断肺结核的阳性预测值为92.54%,阴性预测值为89.65%。见表6、7。

表6 Xpert法和涂片法在确诊及非确诊肺结核患者中的检测结果 (例)

2.7 Xpert法对NTM 感染的诊断价值 在303例痰培养阳性患者中,Xpert阴性但涂片阳性者8例,其中6 例菌种鉴定为NTM。提示在痰涂片、培养阳性但Xpert阴性的病例中,有75.00% (6/8)的概率诊断为NTM 感染,而Xpert阳性患者无一例为NTM 感染。见表8。

表7 Xpert法和涂片法以确诊肺结核患者为金标准的检测效能

表8 Xpert法对NTM 感染的诊断价值(以痰培养及菌种鉴定为诊断标准,例)

2.8 Xpert法对利福平耐药的诊断价值 在297例确诊肺结核病例中,Xpert检出利福平耐药14例,其中有4例药敏试验为敏感;药敏试验检出利福平耐药13例,其中有3例Xpert法为敏感。以药敏试验(即表型耐药)为金标准,Xpert检测利福平耐药的敏感性为76.92% (10/13),特异性为98.59% (280/284),阳性预测值为71.43% (10/14),阴性预测值为98.94% (280/283),利福平总体耐药率为4.38% (13/297)。见表9。

表9 Xpert法对利福平耐药的诊断价值(以药敏试验为金标准,例)

3 讨论

Xpert法是WHO 在2010年推荐的检测MTB DNA 和利福平耐药的快速方法之一[3]。该方法是集痰标本处理、DNA 提取、核酸扩增、MTB特异核酸检测、利福平耐药基因rpoB 突变检测于一体的结核病和利福平耐药结核病快速诊断方法。在结核病高发地区此技术已经作为疑似肺结核的一线检测方法[4]。

本研究对1 059例疑似肺结核患者痰液进行检测,结果显示Xpert法、涂片法、液体培养法阳性率分别为21.53%、12.09%、28.61%,与前期我院刘涛等[5]的研究结果一致;在临床肺结核患者中,三者的阳性率分别为57.29%、30.65%、74.62%,均高于代小伟等[6]的研究结果 (分别为37.9%、22.5%、43.2%)。本研究中Xpert法阳性率明显高于涂片法,但低于液体培养法,此与上述代小伟等[6]的研究结果相符。在实际工作中,不同实验室的Xpert法和液体培养法的阳性率可能会出现一定的差异。这是因为虽然Xpert法仅需要每毫升痰标本中131个杆菌就能检出[4],但液体培养系统只需要10～100个杆菌/ml就能检出[7];一些标本中由于细菌数量较少,低于Xpert检测下限,则不能被Xpert法检测到,但却能被液体培养系统检测到;另外也可能因为患者感染的不是MTB复合群,故Xpert法检测不出,但液体培养可阳性。

在临床工作中,涂片阴性肺结核诊断一直是结核病医师需要面临的一个难点。本研究分析了Xpert法对确诊的涂片阴性肺结核的诊断价值。结果显示,在所有297例确诊肺结核患者中,涂片阴性者(即漏诊者)达180例,占60.61%。在这些涂片阴性病例中,Xpert检测阳性96例,Xpert法对确诊的涂片阴性患者检出率为53.33%。因此,Xpert法能明显提高涂片阴性肺结核的诊断率,减少临床漏诊。肺结核的传染源主要是涂片阳性患者,另外有大约13%的结核病传播发生在涂片阴性、培养阳性的患者中[8]。健康人在与涂片阴性、培养阳性肺结核患者密切接触时,就有可能感染MTB,从而导致活动性结核病的发生。因此,提高涂片阴性患者MTB的检出率有利于肺结核患者的早期诊治及结核病的有效控制。

在肺结核的诊断方面,本研究显示,Xpert法诊断的敏感性为71.04%,特异性为97.77%,敏感性明显高于涂片法(39.39%),而特异性与涂片法(98.56%)相似。研究证实,痰涂片法需要每毫升痰中有5 000～10 000拷贝抗酸杆菌才能产生阳性结果[9],故Xpert法有更高的敏感性 (只需要131个杆菌/ml)。最近的一项meta分析结果显示,在成人疑似肺结核患者,经Xpert检测痰标本诊断的敏感性为66%,特异性为98%[10]。因此,Xpert法是一项特异性高 (接近100%)且敏感性好 (约70%)的肺结核诊断方法。另外,以肺结核确诊为金标准,Xpert 诊断肺结核的阳性预测值为92.54%,阴性预测值为89.65%。该结果提示,如果Xpert检测阴性可在很大程度上排除肺结核。

此外,Xpert有助于鉴别NTM 感染。临床上,NTM 肺病常被误诊为难治肺结核或耐多药肺结核而进行长期抗结核治疗,不仅延误病情,而且增加药物不良反应和经济负担。目前二者的鉴别仍主要依靠痰培养菌型鉴定,耗时较长,不利于疾病的早期诊治。在本研究中共鉴定出NTM 患者6例,这些患者痰Xpert检测结果均为阴性,但涂片和培养结果均为阳性。涂片和培养均阳性而Xpert阴性的病例共有8例。上述结果提示,Xpert阳性患者可排除NTM 感染,涂片和培养均为阳性而Xpert阴性的患者有75.00%的概率为NTM 感染。研究证实,Xpert 系统对NTM 检测无交叉反应[11]。因此,采用Xpert法早期鉴别NTM 感染对于明确疾病诊断、药物治疗选择、病情评估和随访管理等方面均有重要的实际临床应用价值。

Xpert还可以检测利福平基因型耐药性,但可能与表型耐药有一定差异性。本研究采用药敏试验方法共检出利福平耐药13例 (其中3例Xpert法显示为敏感),耐药率为4.38%,略低于全国平均水平 (6.8%)[12]。而采用Xpert法检测出利福平耐药14例,其中4例药敏试验显示为敏感。已知,虽然Xpert法能够检测大量细菌rpoB 基因突变,但却不能检测所有导致利福平耐药的突变基因[13],因此表型耐药患者可能对Xpert 法敏感;一些Xpert法耐药但表型敏感的菌株 (通常认为Xpert假阳性)实际上具有与利福平表型耐药相关的突变,这些假阳性的Xpert检测结果可能是准确的,反映了表型药敏试验的敏感性不足[14]。关于Xpert法诊断利福平耐药的敏感性和特异性,不同作者报道的差异较大,分别为33%～100%和91%～100%[15]。本研究采用药敏试验结果为利福平耐药诊断的“金标准”,计算Xpert法诊断的敏感度和特异度分别为76.92%和98.59%,与刘元等[16]的研究结果(91.5%和95.8%)相比,敏感度偏低,特异度相似。因此,Xpert法在利福平耐药的诊断中有重要价值。临床研究发现,利福平耐药的患者大多对异烟肼也耐药,利福平耐药是耐多药肺结核的重要标志之一[17]。Xpert法的耐药检测不仅有助于利福平耐药的早期诊断,也可以作为耐多药肺结核的快速诊断方法[18],这对于患者治疗方案选择、改善临床疗效和减少疾病传播具有重要的意义。

本研究采用大样本数据全面客观地分析了Xpert法与涂片法、液体培养法之间的差异性,以及Xpert法在涂片阴性肺结核、NTM 鉴定及利福平耐药方面的诊断价值。综上所述,Xpert法是一种简便、快速、准确的痰标本MTB 检测方法。与涂片法相比,Xpert法更敏感;与液体培养相比,Xpert法具有快速、耗时短的优点;Xpert法在肺结核早期诊断、NTM 鉴定、早期筛查利福平耐药等方面有较好的临床价值和应用前景。但Xpert应用也有局限性,仅检测MTB的存在及利福平耐药性,不能区分死菌和活菌,不能检测异烟肼等其他抗结核药物的耐药性。

利益冲突所以作者均声明不存在利益冲突