体外环境下增强纤维蛋白凝胶稳定性的初步研究

骆晓婷 曾奕明

福建医科大学附属第二医院呼吸与危重症医学科 福建省呼吸医学中心,泉州362000

通信作者:曾奕明,Email:zeng_yi_ming@126.com

选择性支气管封堵术治疗难治性气胸是通过封堵材料阻断引流支气管,使破口停止漏气、加速愈合来实现[1]。支气管封堵后胸膜瘘口一般在4～7 d愈合,较大的瘘口可延长至14 d。因此,理想的封堵剂应维持完整的凝胶状态达14 d以上。纤维蛋白凝胶是一种潜在的封堵剂,具有许多良好的生物学特性,如可塑性、可黏附性、生物组织相容性、生物可降解性,且抗原性小,不诱发炎症反应,并有促进新生血管生成及局部组织修复的作用。但纤维蛋白凝胶在体外环境不能稳定存在,在体内环境下血管内皮细胞可释放相关物质使纤溶酶原激活,加上体内某些生物介质及炎症细胞的作用,其降解速度加快,这就限制了其在临床上的应用。如何配制稳定性好的纤维蛋白凝胶是本研究拟探索的问题,因此本研究中选择临床上常用的纤溶酶抑制剂抑肽酶和氨甲环酸,通过在体外制备不同特性的纤维蛋白凝胶,探讨不同浓度抑肽酶或/和氨甲环酸对凝胶溶解过程的影响,期待获得稳定的、降解速度可调控的纤维蛋白凝胶,以便更好地应用于临床。

1 材料与方法

1.1 材料 恒温震荡水槽 (型号DZK-1,上海一恒科技有限公司);纤维蛋白原 (上海翊圣生物科技有限公司);无水氯化钙 (西陇化工股份有限公司);凝血酶冻干粉(湖南一格制药有限公司);抑肽酶(上海生物工程有限公司);氨甲环酸注射液(湖南洞庭药业股份有限公司);精确至0.01 ml的一次性使用无菌注射器(碧迪医疗器械有限公司)。

1.2 方法 采用37 ℃的0.9%氯化钠注射液于37 ℃恒温水槽中溶解纤维蛋白原配置成15 g/L的纤维蛋白原溶液备用。采用常温的0.9%氯化钠注射液分别配制无水氯化钙、凝血酶、抑肽酶及氨甲环酸。无水氯化钙浓度为145 mmol/L;凝血酶浓度为100 IU/ml;抑肽酶分为3组:15 000 kIU/ml(A 组)、20 000 kIU/ml(B 组)、25 000 kIU/ml(C 组);氨甲环酸分为3 组:10 g/L (Ⅰ组)、30 g/L (Ⅱ组)、50 g/L (Ⅲ组)。各取上述配制好的A、B、C 3种浓度抑肽酶或Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ3种浓度氨甲环酸0.1 ml与凝血酶0.5 ml、氯化钙溶液0.1 ml、0.9%氯化钠注射液0.1 ml,于EP 管中充分混匀为混合液,与5 ml纤维蛋白原溶液分别使用注射器向试管中同时注入,充分混匀形成纤维蛋白凝胶。设立未添加抑制剂对照组。将各组凝胶置于37 ℃的恒温水槽中,每个实验组及对照组各8管。

选取抑肽酶25 000 kIU/ml与氨甲环酸50 g/L各0.1 ml,与凝血酶溶液0.5 ml、氯化钙溶液0.1 ml于EP 管中混合均匀成混合液,与5 ml纤维蛋白原溶液按上述同样方法制备纤维蛋白凝胶,并标记联合组为U,总共8 管,各管凝胶均置于37 ℃的恒温水槽中。

每隔24 h 观察凝胶溶解情况,用精确至0.01 ml的一次性注射器将已溶解的液体移出并测量每管的溶解体积,计算剩余体积。

1.3 统计学分析 采用SPSS 22.0统计软件协助完成。每日平均剩余体积采用平均值表示,重复测量资料采用重复测量方差分析,不符合球形性检验则采用Greenhouse-Gesisser进行校正,采用LSD分析进行组间多重比较。P ＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 不同浓度抑肽酶对纤维蛋白凝胶溶解速度的影响 各组凝胶每日剩余体积及溶解时间不同,对照组的溶解时间为5 d,A 组、B 组、C 组的溶解时间分别为13、19、20 d (表1)。通过重复测量方差分析对不同浓度抑肽酶凝胶的总体溶解趋势进行比较,发现不同浓度抑肽酶对凝胶溶解速度的影响差异有统计学意义 (F =502.379,P ＜0.05)。各组每日剩余体积经组间多重比较,对照组与A组、B组、C组比较,A 组与B组、C 组比较,差异均有统计学意义(P 值均＜0.05);B组与C 组比较差异无统计学意义。由此可见,高浓度的抑肽酶可增强纤维蛋白凝胶的稳定性,在同一浓度纤维蛋白原中,抑肽酶＜20 000 kIU/ml,酶浓度的增加可延缓溶解速度,而抑肽酶＞25 000 kIU/ml,凝胶溶解速度无明显变化。

2.2 不同浓度氨甲环酸对纤维蛋白凝胶溶解速度的影响 对照组的溶解时间为5 d,Ⅰ组、Ⅱ组、Ⅲ组的溶解时间分别为7、8、9 d (表1)。通过重复测量方差分析对不同浓度氨甲环酸凝胶的总体溶解趋势进行比较,发现不同浓度氨甲环酸对凝胶溶解速度的影响差异有统计学意义 (F =632.235,P ＜0.05)。各组每日剩余体积经组间多重比较,对照组与Ⅰ组、Ⅱ组、Ⅲ组比较,Ⅰ组与Ⅱ组、Ⅲ组比较,Ⅱ组与Ⅲ组比较,差异均有统计学意义(P 值均＜0.05)。由此可见,在同一浓度纤维蛋白原中,高浓度的氨甲环酸均可增强纤维蛋白凝胶的稳定性,氨甲环酸浓度增加可延缓凝胶的溶解速度。

2.3 抗纤溶剂联合与单用对凝胶溶解速度影响 各组凝胶每日剩余体积及溶解时间不同,C组、Ⅲ组、U 组的溶解时间分别为20、9、31 d(表2)。通过重复测量方差分析对凝胶的总体溶解趋势进行比较,可见抑肽酶+氨甲环酸联合与单用抑肽酶或氨甲环酸对凝胶溶解速度的影响差异有统计学意义 (F 值分别为366.417、262.533,P 值均＜0.05)。由此可见,联合抑肽酶+氨甲环酸延缓纤维蛋白凝胶溶解的作用优于单用抑肽酶或氨甲环酸。

3 讨论

难治性气胸是呼吸科常见疾病之一。笔者前期研究[2]报道了采用自体血+凝血酶进行支气管封堵,成功率达82.4%。国外亦有采用纤维蛋白原+凝血酶成功治疗脓胸引起的支气管胸膜瘘的成功案例[3]。二者的本质均为利用纤维蛋白凝固形成的胶状物对引流支气管或胸膜瘘进行封堵。与支气管塞相比,纤维蛋白凝胶短时间内能自行降解吸收,对瘘口起到临时性的封堵,避免二次支气管镜操作进行支气管塞回收。因此,制备稳定性良好的纤维蛋白凝胶在封堵治疗中具有重要意义。有学者[4]研究发现加入抗纤溶剂均可增强凝胶的稳定性。因此,本实验通过改变抑肽酶及氨甲环酸的浓度,在一定范围内调控纤维蛋白凝胶的溶解速度。

在体内凝固的纤维蛋白的溶解过程关键在纤溶酶原转化为具有活性的纤溶酶。纤溶酶是一种肽链内切酶,能在p H 值约为7的环境中水解纤维蛋白(原)的赖氨酸和精氨酸肽链,使其降解为纤维蛋白原降解产物。在体外环境虽不存在血管内皮细胞可释放物质使纤溶酶原激活,但纤维蛋白凝胶仍不能稳定存在。本实验中对照组及实验组纤维蛋白原浓度均固定,对照组未加入抗纤溶剂,溶解速度较快,在5 d内完全溶解,稳定性欠佳;实验组中加入抗纤溶剂,维持凝胶状态的时间明显延长,溶解速度呈现延缓趋势,可见高浓度的抑肽酶、氨甲环酸均可增强纤维蛋白凝胶的稳定性,延缓凝胶的溶解过程。

表1 各组纤维蛋白凝胶每日溶解情况 (ml)

表2 抗纤溶剂联合与单用凝胶每日溶解情况 (ml)

抑肽酶抑制作用的激活位点是蛋白酶的丝氨酸残基,主要通过与纤溶酶等多种丝氨酸蛋白酶结合形成抑肽酶-蛋白酶复合物,竞争性抑制纤溶酶的活性,抑制程度取决于抑肽酶与纤溶酶的相对亲和力及纤维蛋白浓度。有临床研究[5-7]发现使用抑肽酶后,纤溶酶原激活物减少,纤溶酶原激活抑制因子增加,ɑ-2抗纤溶酶-纤溶酶水平、纤维蛋白原降解产物、D-二聚体水平降低,而纤维蛋白原维持较高的水平,证明其明显抑制纤溶过程。本实验结果表明,抑肽酶可抑制纤维蛋白凝胶溶解,增强其稳定性,与Coffin 和Gauuette[8]的研究结果相符。当抑肽酶浓度＜20 000 kIU/ml时,随着抑肽酶浓度增加,凝胶溶解速度减慢,存在量效关系,与本研究小组前期得到的结果[9]相近。而当抑肽酶浓度＞20 000 kIU/ml时,凝胶溶解速度无明显变化,呈现平台效应。其主要原因是体外环境下蛋白水解酶的量有限,当抑肽酶浓度达到一定程度时(本实验为20 000 k IU/ml),抑肽酶与蛋白水解酶的结合已达到饱和现象,发挥抑制纤维蛋白降解的最大作用,此时继续增加抑肽酶,也不再增强其延缓凝胶降解的作用。本实验还发现,随着氨甲环酸浓度的增加,纤维蛋白凝胶的稳定性进一步增强,溶解速度减慢,呈线性关系。氨甲环酸则通过竞争性地封闭纤维蛋白亲和部位的赖氨酸结合部位,减少纤溶酶原的吸附率,从而减少纤溶酶原的激活,保护纤维蛋白不被降解和溶解,且能直接抑制纤溶酶的活性,减少纤溶酶激活补体的作用。Sitek等[10]认为氨甲环酸作为一种抗纤维蛋白溶解剂,可替代抑肽酶增强纤维蛋白凝胶的稳定性。而从本实验结果来看,氨甲环酸维持凝胶状态的时间较抑肽酶短,溶解速度降低程度小于抑肽酶,抑制凝胶溶解的效果仍不如抑肽酶。

在本研究中与单用抑肽酶或氨甲环酸相比,二者联合应用使溶解反应速率明显降低,提示联合抑肽酶+氨甲环酸可显著延缓凝胶的降解速度,与Meinhart等[11]和张力等[12]的研究结果相符。抑肽酶及氨甲环酸是临床常用的抗纤溶药,二者均通过减少纤溶酶原的激活、抑制纤溶酶的活性而起到抗纤溶作用,但抑制作用的位点各不相同:抑肽酶作用于蛋白酶的丝氨酸残基,氨甲环酸作用于蛋白酶赖氨酸结合位点,因此考虑二者联合作用下可增加抑制纤维蛋白凝胶降解的作用。根据上述实验结果,选取浓度为25 000 kIU/ml的抑肽酶和浓度为50 g/L的氨甲环酸作为联合抗纤溶剂制备纤维蛋白凝胶,可维持9 d不溶解、第14天仍有90%左右纤维蛋白胶体维持凝固状态,可满足临床选择性支气管封堵治疗难治性气胸的需要。

综上所述,在选择性支气管封堵术中,可在纤维蛋白凝胶中加入抗纤溶剂,增强凝胶稳定性,起到较长时间的机械封堵的作用。不同浓度抑肽酶及氨甲环酸对纤维蛋白凝胶的溶解过程的影响有明显差异,在临床应用过程中可根据实际需要改变抑肽酶及氨甲环酸的浓度,对凝胶溶解曲线进行干预,以便更好地应用于实际工作。但本实验纤维蛋白凝胶的制作均在体外环境下进行,与体内环境是否存在差异,需要进一步研究证实。

利益冲突所有作者均声明不存在利益冲突