纳米细菌对HK-2细胞的损伤机制及其防治＊

王敬珅，王议鹤，郝志强，杨 恒，汪 渊，李永乐，王勤章，钱 彪

泌尿系结石是泌尿外科最常见的疾病之一［1］，该病的成因非常复杂，纳米细菌（nanobacteria，NB）感染被认为是导致结石形成的主要原因之一［2，3］，其在肾结石患者的血液、尿液和结石中的阳性检出率均在 90%以上［4，5］。 NB 是一种具有超微结构的人体病原菌，具有较强的感染能力，能在菌体外周形成羟磷灰石结晶外壳，黏附并损害集合管上皮细胞及肾乳头细胞，从而形成结石［6，7］。

随着医学技术的发展，结石的诊断和治疗都有了长足的进步，但碎石治疗后患者的结石复发率仍然很高［8］。因此，探究泌尿系结石的形成机制以寻找新的治疗手段是当前临床中亟待解决的难题。四环素是为数不多的能在生理浓度下杀灭NB的抗菌药物之一，Shoskes等研究了四环素对NB相关慢性前列腺结石患者的治疗效果，其中80%患者的症状在治疗3个月后得到了极大改善，10例患者的结石缩小50%［9］。然而，目前尚不清楚NB是如何在肾结石形成的过程中发挥其独特作用的，更遑论治疗。

该研究旨在通过NB损伤人肾小管上皮细胞HK-2导致晶体滞留的机制研究以及四环素对这一过程的抑制作用，以期为泌尿系结石的预防和治疗提供新的思路。

1 材料与方法

1.1 主要试剂及仪器永生化人肾小管上皮细胞系HK-2细胞购自武汉大学保藏中心。DMEM培养基，1640培养基，胎牛血清，PBS缓冲液 （美国Hyclone公司），一水草酸钙 （Calcium oxalate monohydrate，COM）， 纳米级羟基磷灰石（Nanograde hydroxuapatite，nHAP），四环素，FITC-phalloidin（英国Abcam公司）。二氧化碳细胞培养箱 （美国Thermo公司），扫描仪（日本Canon公司），激光扫描共聚焦显微镜（德国蔡司）。

1.2方法

1.2.1 NB培养与鉴定 于新疆石河子大学医学院第一附属医院泌尿外科收集临床确诊肾结石且未应用药物或手术治疗患者的尿液，将无菌条件下获得的尿液2 ml用生理盐水稀释5倍，4℃离心45 min（14 000 g）；取管底 2 ml混匀，以 0.45 μm 滤纸过滤后，再以生理盐水稀释5倍，4℃离心45 min（14 000 g）；取管底 1 ml液体充分混匀后，经 0.22 μm的滤纸加压过滤。将滤液1 ml注入含DMEM培养液、10%γ-FBS和1%HEPES缓冲液的细胞培养瓶中，37℃、5%CO2条件下培养，5～7 d换 1次液。倒置相差显微镜观察NB生长，筛选出无污染的标本，用吸管吹打均匀后，吸入EP管。12 000 r/min，离心20 min，弃上清液，再加入无菌注射用水1.5 ml吹打混匀。重复上面步骤共计清洗NB 3次，采用NB钙染色（Von KOSSA法）和应用透射电镜扫描（负染法）鉴定。

1.2.2 实验分组 选取HK-2细胞，随机分为5组，NB组（NB菌液、胎牛血清、1640培养液+HK-2细胞），阴性对照组（胎牛血清、1640培养液+HK-2细胞），阳性对照组（5 mmol/L COM悬液、胎牛血清、1640 培养液+HK-2 细胞），nHAP 组 （nHAP、胎牛血清、1640培养液+HK-2细胞）和四环素干扰组（四环素、NB菌液、胎牛血清、1640培养液+HK-2细胞）。

1.2.3 各组细胞透射电子显微镜观察 分别于6 h、12 h、24 h提取各组细胞制成细胞悬液，离心后转移至EP管内，PBS浸泡10 min后弃上清；加入预冷的3%戊二醛固定2 h，PBS洗2次，3 min/次；再加入1%锇酸固定2 h，PBS洗2次，3 min/次；梯度乙醇脱水，经 Epon812∶环氧丙烷=1∶1浸透，包埋后 80℃聚合过夜。行超薄切片、染色。于40透射电子显微镜下观察细胞形态与超微结构变化。

1.2.4 激光共聚焦显微镜检测晶体滞留实验 将HK-2细胞接种于铺有清洁盖玻片的24孔板内，共同培养6 h、12 h、24 h后取出各组样本，加入COM悬液（每孔内 COM 浓度 200 mg/L），轻摇 5～10 s，使COM晶体与底部细胞充分接触。3 min后吸净盖玻片上方液体，加入饱和草酸钠溶液漂洗3次。将盖玻片从孔板中取出，4%多聚甲醛固定20 min，PBS洗2次，5 min/次，摇床轻晃；加入5 mg/L的phalloidin-FITC 50 μl， 室温避光孵育 20 min；PBS洗2次，5 min/次；甘油封片。在488 nm和633 nm激发光下逐一观察各组玻片并进行图像采集。

1.3统计学方法运用SPSS 24.0统计软件（SPSS Inc.，Chicago，IL）进行统计学分析，计量资料以（）表示，组间比较采用t检验。P＜0.05表示差异有统计学意义。

2 结果

2.1各组细胞透射电子显微镜观察结果电镜结果见图1。实验过程中，空白对照组（图1A，B，C和D）细胞膜结构完整正常，膜外微绒毛（黑色箭头）数量丰富，排列规则；双层核膜（黄色箭头）结构正常，核间隙正常；线粒体（红色箭头）形态正常，未见肿胀或萎缩；细胞亚显微结构正常。

实验开始12 h后，NB组细胞膜结构完整，微绒毛结构稍紊乱，局部绒毛消失（黑色箭头，图1E）；细胞核畸形，染色质轻度分布不均，局部染色质凝集（黄色箭头，图1E）；核外膜局部区域降解（蓝色箭头，图1E）；部分线粒体结构轻度肿胀，脊结构模糊不清（红色箭头，图1F）；胞质中偶见髓样小体（图1F）。nHAP组细胞膜局部区域结构破损，微绒毛结构消失（黑色箭头，图1M），绒毛结构消失；部分线粒体结构轻度肿胀，脊结构模糊不清（红色箭头图1N）。胞质中见髓样小体（绿色箭头，图1N）。四环素组细胞膜结构完整，微绒毛结构稍紊乱，局部绒毛消失（图1Q，黑色箭头），绒毛结构消失；细胞核畸形，染色质轻度分布不均，局部染色质凝集（图1Q，黄色箭头）；核外膜局部区域降解（图1R，蓝色箭头）；部分线粒体结构轻度肿胀，脊结构模糊不清（图1R，红色箭头）。胞质中偶见髓样小体（图1R，绿色箭头）。COM组细胞膜局部区域结构紊乱，微绒毛分布不均，局部区域绒毛消失（图1I，黑色箭头）；细胞核染色质边集（图1I，蓝色箭头）；线粒体结构正常，脊结构清晰。胞质中胞质中偶见自噬小体。

实验开始24 h后，NB组细胞膜结构破损，胞核裸露在外（粉色箭头，图1G）；微绒毛基本消失（黑色箭头，图1G），线粒体数量较少，结构肿胀，脊模糊不清（红色箭头，图1H）；胞质中可见较多髓样小体（绿色箭头，图1H），胞质中自噬小体数量较多（棕黄色箭头，图1H）。nHAP组细胞膜结构完整，核膜结构正常；微绒毛分布不均，局部区域绒毛消失（图1O，黑色箭头）；细胞核染色质边集（图1O，蓝色箭头）；线粒体结构肿胀，脊结构模糊不清，局部区域降解（图1P，蓝色箭头）。胞质中偶见髓样小体（图1P，绿色箭头）；胞质中可见自噬小体（图1P，棕黄色箭头）。四环素组细胞膜结构完整，微绒毛基本消失（图1S，黑色箭头）；线粒体数量较少，结构肿胀，脊模糊不清（图1S，红色箭头）。胞质中可见较多髓样小体（图1T，绿色箭头）；胞质中自噬小体数量较多（图1T，棕黄色箭头）。COM组细胞膜结构破损，微绒毛分布紊乱，绒毛消失；细胞核膜阶段性溶解，核膜结构模糊不清（图1L，蓝色箭头）；线粒体结构肿胀，脊模糊不清（图1L，红色箭头）。胞质中见髓样小体（图 1L，绿色箭头）及自噬小体（图 1L，黄色箭头）。

图1见封三。

2.2激光共聚焦显微镜观察结果如图2所示，培养6 h时，NB组、COM组可观察到少量晶体黏附，随着共培养时间延长，两组细胞晶体黏附量进一步增加。共培养6 h和12 h时，nHAP组未观察到明显的晶体黏附现象，当共培养24 h时，可观察到少量晶体黏附。各时间点，干扰组中晶体黏附量均显著少于NB组。

图2见封三。

3 讨论

肾结石的病因非常复杂，其涉及遗传、环境、生活膳食习惯等多种因素［10］。以往认为肾结石是由于pH升高而引起磷酸盐沉积所致，而芬兰科学家CIFTCIOGLU团队通过检测患者的结石成分，发现97.2%的肾结石中含有NB，67%～90%的草酸钙结石核心含有类似NB矿化生成的羟磷灰石，从而认为NB 是肾结石矿化的核心［4，11］。 研究证实，NB 在生长增殖过程中能分泌羟磷灰石类的钙化物，形成钙化生物膜，刺激机体产生以NB为核心的钙化病变［12，13］。

3.1实验研究的分组有文献报道，含钙结石占肾结石的大多数，且约有23.7%的患者合并尿钙代谢异常［14］。近年来，大量文献报道了COM对动物肾小管上皮细胞的损伤作用。李成文等［15］研究发现，将5 mmol/L COM晶体加入Wistar大鼠肾小管上皮细胞的培养液中8 h后，可以观察到大量晶体黏附现象发生。因此，该研究将COM组（5 mmol/L）设为阳性对照组。NB广泛存在于人体血液、尿液及组织器官中，可形成磷酸钙外壳，该外壳成分与nHAP相似。nHAP是一种与人体硬组织的无机成分相类似的生物活性材料，在替代骨组织方面应用潜力较大，但过高浓度的nHAP（200 mg/L以上）会对细胞DNA及大分子物质造成不可逆转的损伤，最终导致细胞凋亡［16］。该研究设置了高浓度nHAP组（300 mg/L）与NB进行各项损伤指标的比较。同时，笔者设置干扰组来检验四环素的杀菌作用，并将其与NB对HK-2细胞的损伤进行对比。

3.2NB损伤人肾小管上皮细胞HK-2导致晶体滞留的机制该研究结果与既往文献报道相一致，用透射电子显微镜观察HK-2细胞的形态学变化发现，NB组和nHAP组对HK-2细胞膜可产生类似的损伤［12］。实验开始后12 h，两组细胞膜结构均完整，线粒体结构出现病变，但NB组细胞核已经出现畸形；实验开始后24 h，NB组细胞膜结构已经出现破损，胞核裸露，且胞质中可见较多髓样小体。结果提示NB组破坏程度比nHAP组严重。既往研究认为高浓度的nHAP（>200 mg/L）可导致细胞大量凋亡或者坏死，该研究中其对HK-2的破坏程度小于NB，提示可能NB的nHAP外壳并不是损伤HK-2的主要物质。随着COM作用时间的推移，胞质中线粒体肿胀加重，胞核逐渐溶解消失。NB和nHAP对细胞的损伤程度也随着作用时间而加重，但主要表现为刷状缘排列紊乱，细胞膜则较完整。通过透射电子显微镜观察发现，nHAP在HK-2细胞中的分布密度比NB高，但对细胞的损伤程度却低于NB。损伤HK-2细胞后，NB组中细胞晶体黏附程度远远高于nHAP组。综合以上结果表明，NB对HK-2细胞的损伤程度及晶体滞留的影响远大于nHAP，提示在损伤HK-2细胞及后续晶体黏附的过程中起主导作用的可能并非NB的磷酸钙外壳，而是其菌体本身。

3.3四环素的抑菌作用得益于矿化生物被膜的保护，NB不仅能够耐高温，脱水、冰冻、紫外线及γ辐射，青霉素、头孢菌素及大环内酯等普通抗生素也对其无效［7，17，13］。 杀灭 NB 的药物有氨苄西林、甲氧苄啶和强力毒素等，但是其对人体产生毒害甚至致死剂量时才发挥药效，因此不能应用于临床［18］。四环素是为数不多的能在生理浓度下杀灭NB的抗菌药物之一，它可以穿透NB的钙质外壳，同时抑制其钙化，从而发挥抗菌作用。有文献报道，四环素在治疗 NB 相关的慢性前列腺炎［9，19］、间质性膀胱炎［20］等方面均取得了不错的效果。Zhou［9］为探讨纳米杆菌感染与Ⅲ型前列腺炎的关系，选取48例慢性盆腔疼痛综合征患者，随机分为两组，一组接受四环素抗NB治疗，另一组接受安慰剂治疗。在治疗前后，分别从患者的前列腺液和尿液中分离培养NB，记录其形态学特征，检测16SrRNA基因的表达，用国家卫生研究院的NB阳性率和症状变化评价疗效。经抗NB治疗后，前列腺液中NB阳性率由62.5%下降到16.7%，前列腺按摩后尿标本则从12.5%下降到0%，而安慰剂组无明显变化。结果显示治疗前后慢性疼痛综合征患者的16SrRNA基因序列并无差别，而治疗后慢性前列腺炎症状指数评分明显下降，而安慰剂治疗后慢性前列腺炎症状指数评分无明显变化。可以认为，四环素是抗NB治疗的有效方法。该研究在损伤HK-2细胞后，电镜显示NB组中细胞晶体黏附程度远远高于四环素干扰组；提示四环素可以抑制NB对HK-2细胞的损伤并减少损伤后的晶体滞留，这一结果进一步确认了四环素在肾结石的预防和治疗方面的有效性，对于该病在临床上的诊治具有积极的意义。

综上所述，NB可损伤HK-2细胞，损伤程度和晶体滞留程度与NB作用时间成正比，四环素可以抑制这一过程。因此，NB可能通过以下途径导致肾结石的形成：NB感染损伤肾小管上皮细胞后，晶体向暴露的基底膜黏附，与NB和坏死细胞碎片共同形成结石。因此运用四环素或其他抗菌药物灭杀NB可能是预防和治疗结石的一个新的方向。