二代测序技术检测呼吸道非典型病原体应用进展

何静 黄丹辉 董航明 蔡绍曦

南方医科大学南方医院呼吸与危重症医学科，慢性气道疾病研究室（广州510515）

呼吸道感染是临床常见疾病，也是主要致死性疾病，根据世界卫生组织（WHO）2018年发布的数据，2016年下呼吸道感染在全球造成300 万人死亡［1］。呼吸道感染的致病原复杂，除常见的细菌外，还有病毒、真菌、支原体、衣原体和军团菌等广义上的非典型病原体［2］。传统的非典型病原体检测技术包括涂片镜检和培养，需要专业人员耗费长时间进行分离和鉴定，且非典型病原体的培养条件往往较苛刻，致检出阳性率低。新兴的免疫学检测和核酸扩增技术包括PCR 和基因芯片检测等步骤复杂、操作要求高，且需要对样本中可能存在的病原体进行预判，无法准确检出混合病原体及未知病原体，难以满足临床及科研需求［3］。

随着分子生物学的发展，通量更高、敏感性更高、速度更快、成本更低的二代测序（next⁃genera⁃tion sequencing，NGS）技术已经广泛应用在微生物组学的研究中，并逐渐与临床病原学诊断相结合，为检测呼吸道非典型病原体提供了新的思路。现将目前关于NGS 技术与呼吸道非典型病原体检测的相关研究进行综述，并对NGS 的应用提出问题和展望。

1 NGS 技术简介

NGS 工作流程主要包括DNA 样本制备、文库构建及验证、大规模克隆扩增和测序，使用了区别于Sanger 测序法的测序化学和单分子聚合酶链式反应，使同时处理数十亿个高质量的碱基对成为可能。基于NGS 发展的感染性疾病病原体检测技术主要包括宏基因组测序（metagenomics next⁃gen⁃eration sequencing，mNGS）、全基因组测序（whole genome sequencing，WGS）以及扩增子测序（以16S rRNA和ITS测序为代表）。目前常见的NGS平台主要有Roche 公司的454 技术、Illumina 公司的Solexa和Hiseq 技术、Helicos 公司的Heliscope 单分子测序仪和ABI 公司的Solid 技术，测序时间一般不超过48 h，最快可以在8 h 内实现从DNA 样本建库到数据分析获取全过程，充分体现其快速、高通量的优点。

2 NGS 在感染性疾病中的应用及优势

2014年WILSON 等［4］应用NGS 技术检出儿童脑脊液样本中的钩端螺旋体，这是世界上第一例临床应用NGS 技术诊断感染性疾病的报道，体现了NGS 技术在检测非典型病原体等难分离、难培养致病原上的优势。MIAO 等［5］报道了目前中国最大规模的关于mNGS 检测感染性疾病病原体的回顾性分析研究，共纳入511 例样本，其中255 例下呼吸道感染，发现mNGS 的敏感度和特异度分别为50.7%和85.7%，显著高于传统培养手段，尤其在检测结核杆菌、病毒、真菌和厌氧菌等病原体上。

《中国成人医院获得性肺炎与呼吸机相关性肺炎诊断和治疗指南（2018 版）》［6］指出，NGS 等分子生物学技术可以提高病原检测敏感度，缩短检测时间，尤其对少见和罕见病原体的诊断有重要意义。综上所述，基于NGS 的病原体检测技术已经逐步在临床诊断领域推广并开始获得认可，临床工作者需要充分认识并选择性地利用这项技术解决临床问题。

3 NGS在呼吸道非典型病原体检测中的应用

3.1 NGS 在诊断呼吸道非典型病原体感染中的应用病毒是呼吸道感染的常见病原体之一，具有种类多、变异快、难分离、培养条件复杂等特点，目前临床上主要采用核酸检测技术进行检测。有研究表明，与基于PCR 的核酸检测相比，NGS 对呼吸道病毒的检出率更高，且能检出被常规检测手段遗漏的病毒［7］。YAN 等［8］报道了1 例经mNGS 诊断的罕见人类鼻病毒（HRV）B91 呼吸道感染，该病例中多重实时PCR 技术也曾检出HRV，但未能进一步鉴定亚型，因此被误认为是非致病病原体。上述报道说明PCR 方法对检测罕见突变株有一定局限性，这与PCR 需要预先设计引物有关，而NGS可以直接对临床样本中的病原体进行鉴定，提高了对罕见呼吸道病毒感染的诊断能力。NGS 技术鉴定新型呼吸道病毒感染的优势在2019年底中国武汉的新型冠状病毒肺炎疫情中得到了充分体现，研究人员在五天内完成了新型冠状病毒的全基因组鉴定和分析，而2013年基于实时PCR 技术进行的H7N9 流感病毒鉴定则耗时1月余［9］。综上所述，实时PCR 技术检测具有速度快、成本低和易获取等优点，适合大规模人群筛查；而NGS 对呼吸道病毒的检出率高，能进一步减少因实时PCR 检测假阴性导致的漏诊，且能弥补PCR 检测诊断罕见或新型病毒感染上的不足。

随着广谱抗生素和免疫抑制类药物使用增加，呼吸道真菌感染的发病率不断增高，而涂片镜检、培养和抗原抗体检测等常规检测手段阳性率较低、难以区分菌种，容易造成漏诊。XIAO 等［10］报道了首例经NGS 检出的尖端赛多孢子菌肺炎，该病例中NGS 在28 h 内得到检测结果，而传统培养技术需要耗时数天。同时，尖端赛多孢子菌的镜下群落形态与曲霉菌相似，容易造成混淆。因此，与传统培养技术相比，NGS 可以更快速、准确地为呼吸道真菌感染提供病原学证据。LI 等［11］对20 例可疑感染的肺活检组织进行研究发现，与组织病理学检测相比，NGS 可以检出更多根霉、毛霉等结合菌，这可能与NGS 样本不需经过研磨加工有关，从而更真实地还原呼吸道真菌群落。

支原体和军团菌的培养要求较一般细菌高，培养阳性率低，而衣原体甚至需要采用细胞培养技术，通常不通过培养进行临床诊断。随着分子病原诊断技术的发展，以PCR 为基础的肺炎支原体、衣原体核酸扩增技术已被批准用于临床，为早期、快速诊断提供依据［12］，体现了核酸检测技术在临床诊断中的重要价值。而NGS 尚未用于呼吸道支原体、衣原体感染的常规检测，其相关报道和研究较少。

李学青等［13］收集34 例重症肺炎患儿的肺泡灌洗液进行分析，其中20 例肺炎支原体感染的mNGS 结果与血清抗体检测结果相符，肯定了NGS检测肺炎支原体的能力。朱榕生［14］和邱崇荣［15］各报道了1 例经NGS 诊断的鹦鹉热衣原体肺炎，弥补了传统检测手段在检测少见病原体上的不足。NGS 理论上可以实现全面、无偏倚地检测病原体，而PCR 技术也有其特异性高、省时等优点，因此现阶段在结合患者临床症状初步考虑呼吸道支原体或衣原体感染可能的情况下，仍推荐使用常规检测方法，将NGS 作为补充手段。

目前尚无NGS 用于呼吸道嗜肺军团菌临床诊断的报道，HUANG 等［16］2019年报道了第一例mNGS 诊断的非嗜肺军团菌关节感染，而传统培养手段未检出军团菌感染，这一报道体现了NGS 在检测军团菌属中有很大潜力。

此外，非典型病原体容易合并细菌感染，常规检测手段难以鉴别，而NGS 可以在单个样本中同时鉴定多个病原体，在鉴别混合感染和多重感染中发挥重要作用。LANGELIER 等［17］在免疫功能受损的呼吸道感染病人的肺泡灌洗液中检测出HCOV 229E、HRV⁃A、HHV⁃6、CMV、HSV、EBV、人乳头瘤病毒及输血传播型病毒等多种病毒，还发现了罕见的轻型链球菌及丙酸棒杆菌，且病毒与细菌共存可明显加重患者的临床症状。王桂祯等［18］报道了1 例多重真菌与细菌混合呼吸道感染，传统镜检和血清学检查均为提示呼吸道真菌感染，痰培养示白念珠菌，但无法明确判断病原菌，治疗效果欠佳，NGS 技术成功检出白念珠菌、曲霉菌、肺炎链球菌等多种病原体，为调整治疗方案指明方向。这提示免疫功能受损或重症呼吸道感染患者可能存在传统检测技术遗漏的多重病原体感染，在抗感染治疗效果欠佳的情况下可进一步行NGS 检测。另外，有研究者提出NGS 可用于快速鉴定肺炎支原体和细菌混合感染，并证实难治性肺炎支原体肺炎中合并细菌感染的情况较少，不应常规联用多种抗生素，从而减少耐药机会［19］。

3.2 NGS 用于指导呼吸道非典型病原体感染治疗NGS 可通过检测呼吸道非典型病原体耐药基因突变及动态监测感染后气道微生物组等方法指导临床抗感染治疗，也有研究者利用NGS 技术研究非典型病原体感染的致病机制，为探讨新的治疗方法提供思路。

PARKER 等［20］对含有流感病毒的鼻咽拭子进行NGS 检测，发现了抗病毒药物耐药性的基因组区域，结果与传统PCR 法完全一致，体现了NGS 在检测耐药基因突变上的可靠性。TREBBIEN等［21］对一名免疫低下的甲型H1N1 pdm09 流感病毒感染患者进行为期6 个月的动态监测，在首次奥司他韦治疗后NGS 检测到H275Y 奥司他韦耐药突变（60.3%），而在第二次扎那米韦治疗过程中检测到H275Y（65.1%）、I223R（9.2%）和E119G（89.6%）等混合耐药突变。这项研究说明免疫功能低下的流感患者在抗病毒治疗过程中可能出现多重耐药，而NGS 可以在检测病原体的同时获取耐药信息，从而及时调整抗病毒治疗方案。值得注意的是，由于目前仍缺少特定耐药突变基因导致耐药表型的相关研究，不能关联耐药基因与相应的病原微生物，临床应用NGS 获取的耐药基因信息时仍需要结合具体的临床信息综合判断［22］。

HU 等［23］利用NGS 技术对一例致死性H7N9 流感病例的气道微生物组进行全程纵向研究，发现抗病毒治疗3 d 后H7N9 病毒的复制受到抑制，证实了抗病毒药物的敏感性。同时，鲍曼不动杆菌和革兰氏阴性菌主导了H7N9 病毒感染后的气道微生物组，而发病9 d 后经痰和血培养证实患者继发鲍曼不动杆菌感染。因此，NGS 的动态检测可以评价呼吸道感染的抗病毒治疗效果，并揭示未来可能出现的继发感染，充分解读这些信息可能对临床医生选择抗病毒药物和优化抗生素联用方案有重要意义，改善患者预后。

因为NGS 的测序深度更高、覆盖度更广，所以与传统PCR 检测相比，基于NGS 的转录组测序可以在样本量更少的情况下，更全面地描述个体或单细胞在某一特定生理条件下的基因表达情况，有助于研究疾病分子水平上的变化和发现新治疗靶点［24］。MAN 等［25］运用NGS 技术进行转录组学分析，发现儿童支原体肺炎患者的NK 细胞和CD8+T细胞有过度增殖和活化的现象，且IFNγ、PRF1、GZMB、FASL 和GNL 等细胞因子表达上调，可能在儿童支原体肺炎的发病机制中起重要作用。对呼吸道肺炎支原体感染后的这种免疫功能失调和细胞因子变化进行干预，可能是新的治疗思路，但是仍需要更多研究证实。

3.3 NGS 用于呼吸道非典型病原体感染暴发监控和调查KOTHARI 等［26］发现某肿瘤病区有呼吸道副流感病毒感染聚集性病例，利用NGS 技术鉴定了病毒株的亲缘关系信息，追踪传播途径，判断出院内发生了副流感病毒传播，而这可能是通过医护人员的互相接触发生的。CHARPENTIER等［27］在一次卡氏肺孢子菌肺炎爆发中利用NGS 联合多位点序列分型进行分析，发现NGS 可以对卡氏肺孢子菌株准确分型，描述传播网络，并提出这项技术有可能进一步确定病原体感染的可能日期及地点。综上所述，因病毒和真菌等非典型病原体的分离培养要求苛刻，限制了利用菌株分型进行疫情跟踪和分析的能力，而NGS 不依赖分离培养的特点使它可以更快捷、更全面地鉴定不同病原体基因型，对管理院内感染、预防传染等有重要意义。

由于NGS 在病毒株特征分型上的优越性，WHO 已将全球流感病毒的NGS 数据纳入监控，作为预测下一季节流感病毒特征的参考，并在2019年基于这些数据分析结果调整了甲型H3N2 流感病毒疫苗的组分［28］。

此外，NGS 还用于环境病原体检测。自然水环境是军团菌的主要来源，对淡水系统的军团菌监测、危害预测和风险评估与人类健康密切相关，NGS 目前也用于评估环境军团菌群，有研究表明其准确度优于实时PCR 检测技术［29］。

4 问题和挑战

NGS 的推广应用仍有许多问题需要解决。第一，NGS 缺乏大样本规范化研究证实其可靠性和优越性。第二，缺乏统一的质控标准和规范的测序流程。第三，目前暂无完善的临床应用指南对解读NGS 报告进行指导，检测出微生物并不等于病原体感染，鉴别致病原和背景菌仍是一大难题。NGS 检测呼吸道非典型病原体也有其局限性，如病毒往往具有较小的核酸序列，且极不稳定、易变异、易降解，尤其是RNA 病毒，需要更高质量的样本储存和运输条件以及更精密的富集策略。而支原体、衣原体、军团菌等胞内感染致病原和真菌等厚壁微生物的DNA 提取效率低，使序列数和覆盖率偏低，最终导致检测敏感度下降。因此，为了在临床推广应用，NGS 及其相关配套技术和条件仍需继续优化［30］。

尽管NGS 的临床应用面临着许多问题和挑战，但它的发展前景是广阔的。已经有研究者提出了更精密的富集目标微生物核酸和去除宿主核酸策略，可以选择性裂解宿主细胞并从临床样本中分离出特定生物［31］。而MYCROBIOTA 等处理平台的开发，逐步减少了嵌合体和DNA 污染等造成的偏差，并提供了一个易于使用的生物信息学管道，可以在不需要高级生物信息学技能的情况下实现NGS 结果的自动化解释［32］。新的测序仪器极大地缩短了测序流程的实际操作时间，可以在24 h 内提供测序结果，而单个样本的测序成本也从70 美元降低到28 美元［33］。因此，未来NGS 技术也将继续提高测序准确度、简化工作流程、优化分析报告和降低成本，实现在临床上的广泛应用。

5 结语与展望

目前NGS 检测呼吸道非典型病原体的研究主要以病例报道和小样本临床研究为主，仍有待进一步的大样本临床研究对比分析其与传统检测手段的敏感度和特异度。NGS 技术在检测呼吸道非典型病原体中有着巨大的潜力，目前已逐步应用到临床诊断、治疗指导以及暴发调查等方面，对改善患者预后和预防易感人群感染有重要意义。虽然NGS 仍不能完全取代目前常规的非典型病原体检测技术，但是随着技术不断革新和临床应用逐步规范，NGS 可以作为一种有效的补充手段［34］，为传统检测技术难以诊断或治疗效果欠佳的病人提供参考，减少不必要的抗生素使用并改善患者预后。同时，NGS 在鉴定新型病原体、指导防疫工作上发挥着不可或缺的作用。在分子病原学诊断技术不断发展的时代，NGS 将成为精准抗感染治疗的关键技术。