二甲双胍对糖尿病小鼠肠道菌群影响的高通量测序研究

刘慧云，谢强，涂忠亮

丰城市人民医院内分泌科，江西 宜春 331100

2 型糖尿病是一种代谢疾病，主要病因是由于肥胖导致身体对胰岛素产生抗性[1]。二甲双胍是治疗2型糖尿病的有效药物，具有耐受性好、廉价和口服使用的优点[2-3]。二甲双胍通过抑制肝脏产生葡萄糖的过程，并且提高身体对胰岛素的敏感性，达到降低血糖的疗效[4-5]。肠道菌群对身体代谢过程有着重要影响。对人和对小鼠的研究都发现，身体增肥过程中，肠道中厚壁菌门微生物占比升高而拟杆菌门微生物占比相对降低[6-7]。在接受胃旁路手术的人的肠道中，普氏菌属微生物丰度在肥胖个体肠道内会大幅升高[8]。有研究报道，在益生元喂养的小鼠肠道种双歧杆菌属微生物的数量增加有助于小鼠的葡萄糖耐受性，也有助于降低炎症水平[9-10]。而对1 型糖尿病大鼠肠道微生物的研究发现拟杆菌属微生物增多时糖尿病症状更容易恶化[11]，而乳酸杆菌属微生物不仅和肥胖相关，还被发现能够调节肠道中的免疫反应[12-13]。综合来看，肠道菌群可通过调整体内脂类物质的代谢、葡萄糖的吸收水平、胆汁酸受体的表达以及体内炎性反应的程度来影响糖类、脂类物质的代谢[22]，可以推测肠道菌群既能够一定程度上反映代谢状态，也能够通过影响代谢从而促进或者抑制糖尿病的发展。本研究则利用16S测序手段调查使用二甲双胍治疗2 型糖尿病过程中肠道菌群的变化情况，并重点分析其中梭菌属、普氏菌属、拟杆菌属、乳酸杆菌属和双歧杆菌属等代谢相关的肠道菌群微生物丰度的变化。

1 材料与方法

1.1 实验材料 SPF 级ICR 雄性小鼠20 只(5 周龄，22 g左右)由江西中医药大学提供。

1.2 主要试剂 四氧嘧啶(629C021，Solarbio)；盐酸二甲双胍(621E024，Solarbio)；Zon Reagent TRIzon总RNA提取试剂盒(1714D，CWBIO)。

1.3 动物造模 SPF 级ICR 雄性小鼠9 只，体质量22 g左右，随机选3只作为对照组(BMCK、M2WCK和M42CK)，其余6只高糖高脂饮食饲养4周后腹腔注射四氧嘧啶溶液180 mg/kg，3 d 后测小鼠空腹血糖。以空腹血糖大于11.1 mmol/L 为糖尿病小鼠造模成功[14-15]。糖尿病小鼠随机均分为二甲双胍治疗组(BMMet、M2WMet 和M42Met) 和 模 型 组(BMMod、M2WMod 和M42Mod)。二甲双胍治疗组给与每日两次二甲双胍600 mg/mL 灌胃，对照组和模型组给与生理盐水灌胃。4周后取粪便提取微生物总RNA。

1.4 RNA提取 向小鼠粪便种加入PBS，匀浆后制成悬浊液，用筛子过滤掉渣滓。100×g离心3 min后留沉淀，磷酸盐缓冲液(PBS)重悬清洗，如此离心重悬2次后得到再次离心收集沉淀的微生物，加入TRIzon，根据试剂盒说明书提取微生物总RNA，得到总RNA后加入RNA酶抑制剂后寄往高通量测序公司。

1.5 数据分析 使用QIIME软件，调用UCLUST这一序列比对工具，高通量测序所得的序列按97%的序列相似度进行归并和OTU 划分，并选取每个OTU中丰度最高的序列作为该OTU的代表序列，然后比对RDP (Ribosomal Database Project)数据库得到分类鉴定结果。随后，根据每个OTU在每个样本中所包含的序列数，构建OTU在各样本中丰度的矩阵文件[16-17]。

微生物分类进化等级树是通过使用GraPhlAn 软件将每个样本所含有的OTU 的丰度信息和分类学组成数据映射至NCBI Taxonomy 所提供的微生物分类等级树而得到的[18]。

PCA分析通过线性变换，将原始的高维数据(如菌群OTU 丰度矩阵)通过线性变换组合，投影到维度较低的空间坐标系(即主成分)中，从而达到降维、简化数据结构的目的，展现样本的自然分布[19]。PCA 分析能够从原始数据中提取样本间最主要的差异特征，并根据这些差异特征将样本在新的低维坐标系中依次排序，使得样本在新坐标系中的距离远近能在最大程度上还原样本间的实际差异。通过R 软件对PCA 分析得到的二维数据作图，可以得知群落样本的主要分布特征，从而量化样本间的差异和相似度。

2 结果

2.1 肠道微生物16S 测序定性分析结果 可操作分类单元(Operational Taxonomic Unit，OTU)指根据序列相似度设置阈值，将测序得到的各样本的序列进行归并，彼此间相似度高于该阈值的序列都将归并为一个OTU。目前大多数基于16S rRNA基因的菌群结构多样性研究中，通常都以97%的序列相似度作为OTU 划分阈值，该阈值大致相当于分类学中物种(Species)水平的序列差异。

将丰度值低于全体样本测序总量0.001% (1/100 000)的OTU 去除后进行OTU 划分并对分类地位[21]鉴定结果进行统计，见表1。

表1 肠道微生物16S测序分类鉴定统计

对OTU 丰度矩阵中每个样本的序列总数在不同深度下随机抽样，以每个深度下抽取到的序列数及其对应的OTU数绘制稀疏曲线。如图1所示，图中各样品曲线随测序深度增加已经变得平缓，表明测序结果已足够反映当前样本所包含的多样性。

肠道微生物分类进化等级树分析结果如图2所示。在门水平丰度最高的是A.厚壁菌门(Firmicutes)，K.拟杆菌门(Bacteroidetes)次之。在属水平丰度最高的是J.乳酸杆菌属(Lactobacillus)，F.异杆菌属(Allobaculum)次之。

2.2 肠道微生物丰度比较 各样本在门分类水平所含有的微生物类群数量，如图3所示；各样本在属分类水平所含有的微生物类群数量，如图4所示；总体丰度前50 位的属在各组样品中丰度水平，如图5 所示。3个糖尿病模型组小鼠肠道微生物中都出现了乳酸杆菌属微生物显著减少的情况，而其中两个出现了Allobaculum属微生物增多的情况；而3 个二甲双胍治疗糖尿病组小鼠肠道微生物中都出现了乳酸杆菌属微生物恢复性增多的现象。

图1 稀疏曲线(Rarefaction curve)

图2 分类等级树

图3 门水平分类学组成和分布图

图4 属水平分类学组成和分布图

图5 总体丰度前50位的属在各组样品中丰度水平

图6 组间PCA分析

2.3 代谢相关的肠道微生物变化情况比较 将每组的三只小鼠的肠道微生物丰度数据取平均值，然后对三组的数据进行主成分分析(principal component analysis，PCA)，组间PCA 分析结果见图6。根据文献选择了梭菌属、拟杆菌-普氏菌属、拟杆菌属、乳酸杆菌属和双歧杆菌属等代谢相关的肠道微生物种群进行组间丰度变化情况分析，根据PCA 分析结果，每个属的微生物中选择组间差异最大的两种微生物，筛选出的微生物在组间丰度变化情况见表2～表6。其中梭菌属、拟杆菌属、乳酸杆菌属微生物出现了二甲双胍处理组的微生物丰度在对照组和模型组之间的情况。

表3 拟杆菌-普氏菌属(Bacteroides-Prevotella)差异情况

表2 梭菌属(Clostridium)差异情况

表5 乳酸杆菌属(Lactobacillus)差异情况

表4 拟杆菌属(Bacteroides)差异情况

表6 双歧杆菌属(Bifidobacterium)差异情况

3 讨论

本研究试图增加对两个问题的了解，一是对糖尿病模型组小鼠的肠道微生物和对照组小鼠的正常肠道微生物进行比较，研究糖尿病造模导致模型小鼠血糖水平保持在偏高的状态下对肠道微生物的影响；二是对糖尿病模型组小鼠肠道微生物和接受二甲双胍灌胃给药的糖尿病小鼠肠道微生物进行比较，研究二甲双胍灌胃给药而降低血糖水平的条件下有哪些微生物的丰度更接近正常组的状态，并且研究二甲双胍本身对小鼠的肠道微生物是否有显著的影响。

从各肠道菌群样本在门分类水平所含有的微生物类群数量可以发现，厚壁菌门和拟杆菌门是丰度最高的一块，占总微生物80%以上的比例。三只模型组小鼠相对于正常组小鼠，都出现了厚壁菌门微生物占比降低而拟杆菌门微生物占比升高的现象。二甲双胍治疗组小鼠相对于模型组小鼠，有2 只小鼠出现了厚壁菌门微生物占比上升而拟杆菌门微生物占比下降的现象，可以认为这2 只二甲双胍治疗组小鼠的厚壁菌门和拟杆菌门微生物丰度水平向正常组的状态转化。而二甲双胍治疗组的另一只小鼠出现了拟杆菌门微生物占比下降的现象，但是疣微菌门(Verrucomicrobia)的微生物占比大幅上升，厚壁菌门微生物占比变化幅度不大。其他研究中发现肠道微生物中厚壁菌门微生物占比升高而拟杆菌门微生物占比降低有助于身体肥胖[6]，本实验则发现发现糖尿病造模对厚壁菌门和拟杆菌门微生物的占比有着相反的效果，可以推测糖尿病状态下身体保持高血糖水平，糖分转化为脂肪过程受抑制等代谢状态也反映到肠道微生物丰度水平上。

进一步细化到属分类水平，可以发现相对于正常组，3 个糖尿病模型组小鼠肠道微生物中都出现了乳酸杆菌属(属于厚壁菌门)微生物显著减少的情况，而3个二甲双胍治疗糖尿病组小鼠肠道微生物中都出现了乳酸杆菌属微生物恢复性增多的现象。在各个样品中乳酸杆菌属微生物的丰度在厚壁菌门微生物中数一数二，可以认为乳酸杆菌属微生物在菌群变化中起着决定性的作用。而在M4WMet 小鼠肠道微生物中占比大幅上升的疣微菌门微生物基本上是阿克曼西亚属(Akkermansia)微生物。有研究报道，二甲双胍给药的肥胖小鼠肠道微生物中阿克曼西亚属属和梭菌属微生物占比显著上升，而且具有抑制脂肪代谢过程的效果[20]。本研究在进一步的数据分析中选择了梭菌属、拟杆菌-普氏菌属、拟杆菌属、乳酸杆菌属和双歧杆菌属等与肥胖或者糖尿病相关的肠道微生物种群进行组间丰度变化情况分析，根据PCA分析结果每个属的微生物中选择组间差异最大的两种微生物，筛选出的微生物在组间丰度变化情况显示其中梭菌属、拟杆菌属、乳酸杆菌属微生物出现了二甲双胍处理组的微生物丰度在对照组和模型组之间的情况，也就是说二甲双胍给药让糖尿病小鼠肠道中梭菌属、拟杆菌属、乳酸杆菌属微生物丰度向正常状态转变，可以推测这三个属的微生物与二甲双胍治疗糖尿病的过程有较高的相关性。

综上所述，受二甲双胍影响，糖尿病小鼠肠道菌群微生物会更倾向抑制脂肪代谢减轻肥胖，达到有利于减轻糖尿病的效果。而梭菌属、拟杆菌属和乳酸杆菌微生物可以作为二甲双胍对肠道菌群影响的标志性微生物。