食管鳞状细胞癌piRNA-19166的表达及其临床病理意义

郭玉莲, 颜 云, 王成海, 3

(1.扬州大学医学院/转化医学研究院 病理学教研室, 江苏 扬州, 225009;2.江苏省宝应县人民医院 病理科, 江苏 宝应, 225800;3.江苏省中西医结合老年病防治重点实验室, 江苏 扬州, 225009)

食管癌是消化系统常见的恶性肿瘤，其发病率位居所有疾病的第9位以及癌症相关死亡疾病的第6位[1]。食管癌的病理组织学类型主要包括食管鳞状细胞癌和食管腺癌，而食管鳞状细胞癌是亚洲地区常见的病理类型[2]。在中国，食管鳞状细胞癌占所有食管癌的90%, 其主要发病部位为食管的中下段[3-4]。食管癌致病的危险因素有饮食习惯、环境因素和遗传因素等[5]。近年来，与PIWI蛋白相互作用的核糖核酸(piRNAs)逐渐成为肿瘤研究的热点之一, piRNAs是在生殖细胞和体细胞中发现的一类非编码RNA[6], 包含24～31个核苷酸, piRNAs与PIWI蛋白结合形成piRNA/PIWI复合物，对精子形成、表观遗传调节和生殖干细胞维持等均有影响[7]。研究[8-9]表明piRNAs与包括恶性肿瘤在内的多种疾病有关。多项研究[10-11]证实, piRNAs异常表达已经成为肿瘤细胞增殖、凋亡、侵袭、迁移的关键因素。本研究采用实时荧光定量聚合酶链式反应(qRT-PCR)技术检测piRNA-19166在食管鳞状细胞癌及相应癌旁正常组织中的表达水平，分析piRNA-19166表达水平与食管鳞状细胞癌病理参数的相关性及临床病理意义，现报告如下。

1 材料与方法

1.1 实验材料

选取2018年10月—2020年3月扬州大学附属医院96例外科手术患者的新鲜食管鳞状细胞癌组织和相应正常食管组织标本，年龄39～74 岁，中位年龄62.0岁; 男50例，女46例。所有患者术前未经过放疗和化疗处理。食管鳞状细胞癌由病理科医师明确诊断。标本使用及临床资料的收集均经扬州大学医学院伦理委员会批准，并与患者签署知情同意书。采集新鲜食管鳞状细胞癌组织后立即放入液氮罐里,-80 ℃冰箱内保存备用。

1.2 qRT-PCR

提取食管癌肿瘤组织总RNA, 将RNA逆转录成互补DNA(cDNA), 使用 Takara 生物公司qRT-PCR反应试剂盒，反应体系为25.0 μL, cDNA为1.0 μL, 12×SYBR Premix ExTaqTM Ⅱ 2.5 μL, 上、下游引物各1.0 μL, 加无核酸酶水调整体系至25.0 μL, 每组样本有3个复孔，内参为U6。最后在Applied Biosystems 7500 Real-Time PCR system仪器上读取定量PCR反应Ct值，结果以2-ΔΔCt计算。

1.3 统计学分析

2 结 果

2.1 食管鳞状细胞癌组织piRNA-19166的表达

96例食管鳞状细胞癌组织中, 71例piRNA-19166表达下降, 25例表达正常或升高; 与癌旁正常食管组织相比，食管鳞状细胞癌中piRNA-19166呈低表达，差异有统计学意义(P<0.01)。见图1。

与食管癌组织比较, **P<0.01

2.2 食管癌细胞株中piRNA19166的表达

应用实时荧光定量实验方法检测3种食管癌细胞系(EC9706, TE-1, ECa10)及正常食管上皮细胞(HEE-1)中piRNA-19166的表达情况，结果显示，与正常食管上皮细胞相比, piRNA-19166在食管癌细胞株EC9706、TE-1、ECa10中均呈低表达，其中ECa10细胞、EC9706细胞中piRNA-19166低表达差异有统计学意义(P<0.05或P<0.01)。见图2。

与HEE-1比较, *P<0.05, **P<0.01。

2.3 食管鳞状细胞癌组织中piRNA19166的异常表达及其与临床病理的关系

本研究分析piRNA-19166在RNA水平上的相对表达量与患者年龄、性别、吸烟情况、肿瘤大小、分化程度、淋巴结转移和TNM分期的关系。根据食管鳞状细胞癌组织中piRNA-19166的表达水平分为低表达组和正常/高表达组。结果显示, piRNA-19166低表达与分化程度(P=0.001)、淋巴结转移(P=0.001)、TNM分期(P=0.006)有显著相关性。见表1。

表1 食管鳞状细胞癌组织中piRNA19166的表达及其与临床病理的关系

3 讨 论

食管癌是一类来源于食管鳞状上皮和腺上皮的癌症，其发病率位居消化系统肿瘤的第3位[12-15]。在中国，绝大多数食管癌的病理类型为鳞状细胞癌，因此研究食管鳞状细胞癌的病因、发病机制、诊断指标和治疗靶点尤为重要。作为一类小的非编码蛋白RNA, piRNA与PIWI蛋白结合而发挥其生物学活性作用[16-18]。大多数piRNAs在人类发生肿瘤时会出现表达异常，只有少数piRNAs在肿瘤和正常组织中表达一致[19-20]。目前, piRNA对肿瘤发生、发展的影响已经成为肿瘤研究的新热点，许多piRNAs在肿瘤组织中表达失调，发挥促进或抑制的作用。微小RNA也是一类小的非编码蛋白RNA, 通常与靶基因的3′非翻译区互补结合，抑制其蛋白质翻译，而piRNAs一般不与靶基因的DNA互补，这表明piRNAs通过其他生物学方式发挥表观遗传调节作用[21-22]。

目前多认为piRNAs的异常表达是一种癌症潜在的病理性特征, LI BB等[23]研究表明，由多发性骨髓瘤细胞外囊泡携带的piRNA-823能改变内皮细胞的生物学特性，这一点对于多发性骨髓瘤细胞能适合生长的独特环境至关重要，也为piRNAs治疗多发性骨髓瘤的预后评估提供了前期研究基础。在大肠癌患者组织和血清中, piRNA-54265表达水平升高，并与患者预后较差密切相关。功能性试验[24]证明, piRNA-54265结合PIWIL2 蛋白通过PIWIL2/STAT3/p-SRC复合体激活STAT3信号通路，促进大肠癌细胞的增殖、转移以及抗药性。LIN X等[25]运用piRNAs芯片技术在胃癌组织中鉴定出50种与癌症相关的piRNAs, 得出piRNAs在致病因子中扮演重要的角色。在乳腺癌组织中, piRNA-36712的表达水平显著低于正常乳腺组织，低水平的piRNA-36712与患者的临床预后不良相关, piRNA-36712的下调引起硒蛋白W1(SEPW1)过度表达，从而促进癌细胞的增殖、侵袭和迁移。研究[26]还发现, piRNA-36712与紫杉醇和阿霉素这2种乳腺癌化疗药物具有协同抗癌作用。

本研究采用qRT-PCR技术检测出食管鳞状细胞癌组织中piRNA-19166表达水平下降的比率约为74.0%, 而在少数患者中piRNA-19166是正常表达或高表达; 同时, piRNA-19166在食管癌细胞株中的表达水平也低于正常的食管上皮细胞株。上述结果提示, piRNA-19166可能是一种新的食管癌肿瘤抑制基因，其失活或受到抑制后影响了食管癌的发生、发展过程。本研究还分析了piRNA-19166在食管鳞状细胞癌组织中的表达水平与患者临床病理参数的相关性，证实低表达的piRNA-19166与食管鳞状细胞癌的分化程度、淋巴结转移和TNM分期密切相关，即piRNA-19166表达水平越低，食管癌的分化程度越低，癌细胞恶性程度越高，癌细胞越容易从附近的淋巴结转移，以及TNM分期越晚，患者预后也就越差。

综上所述, piRNA-19166可能是一种新的食管癌肿瘤抑制基因，低表达的piRNA-19166促进了食管癌的发生、发展和转移。