口腔鳞状细胞癌患者组织、血清及血清外泌体中脂多糖结合蛋白的表达水平及意义

董建伟, 朱含九, 李阿峰

(1.陕西省商洛市中心医院 口腔科, 陕西 商洛, 726000;2.陕西省商南县中医院 口腔科, 陕西 商洛, 726300)

口腔鳞状细胞癌(OSCC)是一种发生于口腔颌面部的恶性肿瘤，男性患者多于女性[1]。脂多糖也被称之为内毒素，是组成革兰阴性菌外膜的主要成分[2]。脂多糖结合蛋白(LBP)是脂多糖在急性期与蛋白脂多糖结合成形的蛋白成分，能够导致机体免疫防御屏障功能下降，引发全身炎症性反应或急性肺损伤以及脓毒性休克等疾病[3-4]。LBP能够促使单核巨噬细胞产生大量炎症介质，增加幽门螺杆菌数量，进而增高胃癌风险。因此LBP水平与恶性瘤的发生、发展有着密切关系。本研究探讨OSCC患者血清、组织、血清外泌体中LBP的表达及意义，现将结果报告如下。

1 资料与方法

1.1 一般资料

将2016年10月—2019年10月确诊为OSCC的60例患者设为观察组，选取同期60例健康体检者作为对照组。观察组男40例，女20例; 年龄60～75岁，平均(66.36±1.20)岁; 对照组男36例，女24例; 年龄56～74岁，平均(65.89±1.59)岁。2组一般资料比较，差异无统计学意义(P>0.05)。

1.2 方法

组织检测: 采集所有观察组患者的癌组织(需要避开糜烂区域癌组织)以及癌旁组织(距肿瘤边界2 cm以上位置取标本)[9], 置于RNA Keeper Tissue Stabilizer的空管以及EP管中，放置于-80 ℃保存。采用北京全式金生物技术有限公司生产的聚合酶链式反应(PCR)试剂进行检测，试剂盒为配套产品，严格按照操作说明书进行。

样本RNA提取以及cDNA的合成: 取出RNA保护液中的癌旁组织以及癌组织，剪碎处理、进行匀浆，提取总RNA, 再使用配套试剂盒进行cDNA的转录，然后进行荧光定量试验。反应总体系为20 μL, 反应程序为预变性: 95 ℃, 30 s。PCR: 95 ℃, 5 s; 60 ℃, 30 s; 40个循环。熔解: 95 ℃, 15 s; 95 ℃, 1 min; 95 ℃, 15 s。

血清采集: 采集所有研究者肘静脉血5 mL, 离心15 min后取上清液，在-80 ℃的环境中保存。外泌体制作: 取250 μL血清，加入63 μL Exo-Quick ExosomePrecipitation solution, 进行分泌体裂解，保存于-80 ℃的环境中。选取BCA试剂盒测定样品外泌体蛋白质浓度，在其中加入5XSDS缓冲液，变性95 ℃, 10 min, 保存于-80 ℃的环境中。

血清及外泌体蛋白水平测定: 采用蛋白免疫印迹法，将LBP抗体置96孔板，包被处理，加入待测样品以及标准品，并加入生物素化的LBP抗体，之后充分洗涤，加入抗生物素蛋白-生物素-过氧化物酶复合物，发生HPR催化TMB产生蓝色产物后终止反应，在15 min内空白调零，通过酶标仪测量450 mm 波长下吸光度，即为OD值。

1.3 观察指标

① 比较OSCC患者癌组织、癌旁组织中LBP mRNA表达水平，分析OSCC患者癌组织中LBP mRNA的表达水平与临床特征的关系; ② 统计并分析健康体检者与OSCC患者血清外泌体以及血清LBP表达水平; ③ 统计并分析OSCC患者血清LBP表达量与临床特征的关系; ④ 统计并分析OSCC患者血清外泌体LBP表达量与临床特征的关系[10]。

1.4 统计学分析

2 结 果

2.1 OSCC患者癌组织LBP mRNA的表达水平与临床特征关系分析

OSCC患者癌组织中LBP mRNA表达量为(0.81±0.23), 癌旁组织表达量为(0.91±0.44), 差异无统计学意义(t=1.560,P=0.061)。吸烟、饮酒患者中LBP mRNA表达量在癌组织中较高，差异有统计学意义(P<0.05)。见表1。

表1 OSCC患者癌组织中LBP mRNA表达水平与临床特征关系分析

2.2 健康体检者与OSCC患者血清外泌体表达水平以及血清LBP表达分析

2组血清外泌体LBP表达水平比较，差异无统计学意义(P>0.05); 2组血清LBP表达水平比较，差异有统计学意义(P<0.05)。见表2。

表2 2组血清外泌体以及血清中LBP

2.3 OSCC患者血清外泌体LBP mRNA表达量与临床特征关系分析

淋巴转移、饮酒OSCC患者血清外泌体LBP mRNA表达量高于无淋巴转移及不饮酒患者，差异有统计学意义(P<0.05), 见表3。

表3 OSCC患者血清外泌体LBP mRNA表达量与临床特征关系分析

2.4 OSCC患者血清LBP mRNA表达量与临床特征关系分析

OSCC患者血清LBP mRNA表达量与TNM分期、淋巴转移、分化程度、吸烟、饮酒等临床特征无显著相关性(P>0.05)。

3 讨 论

研究[11-14]显示，特异性肿瘤标志物最易在人体血清中发现，因此应该对恶性肿瘤患者进行血清以及血清外泌体指标监测。本研究结果发现，癌组织与癌旁组织中的LBP mRNA表达量比较，差异无统计学意义(P>0.05), 吸烟、饮酒OSCC患者LBP mRNA含量高于无抽烟、饮酒习惯的患者，说明饮酒、抽烟是OSCC发展的促进因子[15-17]。

本研究对OSCC患者与健康体检者血清以及血清外泌体蛋白质进行了分析，结果表明, 2组血清外泌体LBP表达水平差异无统计学意义(P>0.05), 提示OSCC患者血清外泌体中LBP含量与健康人群比较无显著差异，但OSCC患者伴有淋巴转移或者有饮酒习惯时，则LBP含量明显升高。可见，外泌体中的LBP含量是OSCC的驱动因子。此外，2组血清LBP表达水平比较，差异有统计学意义(P<0.05)。

综上所述，LBP是一种Ⅰ型急性期反应蛋白，存在于人体血清中，当人体出现炎症反应时，其浓度明显增高[18-19]。本研究结果证实，LBP可以作为OSCC转移的标志物，也可以作为靶向治疗的突破口。因此，检测OSCC患者血清中的LBP水平对于早期诊断和治疗具有重要意义。此外，改善患者抽烟、饮酒不良习惯，能够促进身体恢复。