NF1突变类型及相关研究进展

2020-12-25刘芷兮肖洪涛

实用医院临床杂志 2020年2期

刘芷兮，陈燕，肖洪涛，2△

(1.四川省肿瘤医院·研究所、四川省癌症防治中心，临床药学部；电子科技大学医学院，四川成都 610041；2.个体化药物治疗四川省重点实验室，四川成都 610041)

I型神经纤维瘤病 (neurofibromatosis type 1)是常染色体显性遗传病，每3000个新生儿中就有1个患儿，其致病基因位于常染色体17q11.2。它是由肿瘤抑制基因NF1突变引起的，NF1基因在17q11.2处有一个大基因座(350 kbp)，它包含61个外显子，其中含有4个交替拼接的外显子，转录后大小为12 kbp信使RNA(mRNA)，其中包含8454个核苷酸的开放阅读框[1]。该基因编码ras信号通路的负调节因子，突变主要影响神经嵴衍生组织类型(如雪旺细胞和黑素细胞)[2]。外显率为100%，其中的大部分患者，为散发式病例，临床表现复杂，且涉及多个系统[3]。患有NF1的儿童和成人出现包括良性和恶性肿瘤在内的疾病，包括认知缺陷、癫痫发作、生长异常、周围神经病变和以咖啡色斑点和辅助雀斑的形式出现的异常色素沉着。神经系统也会出现并发症，如不受控制的偏头痛等[4]。

1982年，神经纤维瘤病被分为7类[5]，NF1也称冯雷克豪森氏病，占神经纤维瘤病的85%以上也是本文主要的研究对象。NF2为听神经鞘瘤病，与NF2基因失活有关，有颅内肿瘤，一般表现为头晕，耳鸣，视力下降，症状存在时间可数月至数年不等。NF3为混合型神经纤维瘤病，具有NF1与NF2两种表征。NF4为变异型神经纤维瘤病。NF5为节段型神经纤维瘤病(segmental neurofibromatosis，SNF)。NF6是仅有牛奶咖啡斑型神经纤维瘤病，NF7为迟发型神经纤维瘤病，发病在30岁以后[6]。

阐明NF1基因突变的类型，对于涉及相关疾病的基础和临床研究具有重要的意义，本文主要聚焦NF1的突变及相关表型，NF1基因突变无规则无序，总结NF1突变包括以下多种类型：染色体畸变、多个外显子缺失、大插入、终止突变(无义突变)、氨基酸替代、内含子突变及3’ 端非翻译区突变等，新发突变高，且无明显热点突变。其中体细胞倾向于缺失，而生殖细胞倾向于点突变。

1 突变类型

1.1 错义突变错义突变通常是指编码某一种的氨基酸的密码子由于错误的碱基互补配造成氨基酸的改变，致使蛋白质丧失原有的功能与结构。柳州市妇幼保健院日前，对一例先证者为Ⅰ型神经纤维瘤病的患儿进行基因突变鉴定与家系研究。该患儿女，8岁，生后即有神经纤维瘤典型体征，躯干与四肢牛奶咖啡斑，2岁超声显示，左眼眶周肿块等。使用高通量测序与sanger测序发现该患儿NF1基因c.1013 A>G杂合变异，该变异导致第338号氨基酸由天冬氨酸变为甘氨酸 (Asp变为Gly)，为错义突变，患儿生物学父母该位点未见异常，分析为散发的错义突变[3]。

1.2 无义突变无义突变通常是指因为DNA的突变提前出现终止密码子导致，使多肽链合成中断，形成一段无意义的蛋白。重庆医科大学17年报道了一例NF1无义突变的病例。患儿女(先证者)，11岁。躯干及四肢见散在牛奶咖啡斑、腋窝雀斑及皮肤神经纤维瘤。患儿家族中有类似疾病史，临床诊断为Ⅰ型神经纤维瘤病(NF1)。基因测序明确突变位点为NF1基因c.2351 g>A，该突变是第一次在NF1基因中报道。先证者母亲幼儿时也有Ⅰ型神经纤维瘤体征，经测序发现患儿母亲与患儿携带相同突变。国际人类基因突变数据库(HGMD)还未检索到该突变[7]。

湖南航天医院皮肤科报告1例I型神经纤维瘤家系并进行基因突变的检测。先证者男，5岁，PCR产物经测序发现，先证者NF1基因的第2 620位碱基出现A/T杂合突变(c.2620 A >T)，致874位密码子由原来编码赖氨酸(Lys) 的AAG突变为TAG，形成提前终止密码子，故造成蛋白截断。而先证者的父亲、祖母中也存在相同的突变，在(HGMD)中也尚未见此突变报告[8]。

1.3 基因大片段缺失与剪切突变北京协和医院在2016年分析了8例Ⅰ神经纤维瘤的病例，8例患儿就有7种突变的形式。其中两例为NF1基因全部缺失，一例为基因的剪切突变c.3975-2delA(成熟RNA中含有内含子或缺失外显子序列的一类突变。)一例无义突变c.3721 C>T，p.R 1241 X。另外5名患者分别为四种突变则为c.49744977delCTAT，p.Y1659 TfsX17、c.39873988delAG，p.S1329fsX4、c.1511delC，p.P504QfsX22和c.6388delC，p.L2130fsX3[9]。

1.4 移码突变(缺失突变)2014年，中国麻风皮肤病杂志刊登了NF1基因突变突变检测的一篇文章，该两名患者均有NF1典型体征，出生时躯干和四肢有咖啡牛奶斑，随着年龄增长不断扩大，但两者听力视力智力均正常。文章就这两名患者进行sanger测序，其中一位患者测序结果为27号外显子存在c.3691delA移码突变(p.R1207DfsX8)[10]。安徽医科大学陈滨的硕士学位论文中报道了一位NF1基因无义突变的患者(c.3443-3444delCA)，20号外显子第3443-3444位置的两个碱基缺失，导致后续终止密码TGA提前出现，形成截短蛋白[11]。移码突变是指在DNA片段中丢失或插入一个或几个碱基，可以不是三的倍数，引起遗传信息的改变。

2 NF1缺失类型分类

根据Dorschner等的相关研究[12]，总的来说可将NF1的缺失类型分为4大类(第1，2，3和非典型缺失)。1型缺失占所有大型NF1缺失的70～80%[13]，大多数1型NF1缺失是因为卵母细胞在减数分裂过程中，染色体间非等位基因同源重组(NAHR)造成的。NF1基因中的NAHR是由NF1-repa和NF1-repc所介导的低拷贝重复序列引起的。在这些低拷贝重复中，检测到两个NAHR热点内重复的断点(recurrent breakpoints)，称为同源重组位点1和2[14]。2型NF1缺失通常是由有丝分裂过程中的NAHR引起的，因此与体细胞位点缺失有关[15]。与1型NF1缺失相比，2型缺失与13个蛋白质编码基因的半合子性相关。至少10%的大型NF1缺失属于2型，也许还远远不止[16]。3型NF1缺失非常罕见，这些1.0 MB的缺失仅发生在所有NF1总缺失患者中的1%～4%，并且是由NF1-repb和NF1-repc之间的NAHR介导引起的，导致总共9个蛋白质编码基因的半合子性。非典型的NF1缺失并不表现出重复的断点，并且就其大小和位于缺失区域内的基因数量是非常不同的。非典型NF1缺失不仅在其长度上是高度异质，而且就其潜在的突变机制而言，可能涉及异常DNA双链断裂修复或复制以及反转录转座子介导的机制[17]。

3 基因型与表型关系

迄今为止，仅鉴定了NF1中的少数的基因与表型的关系。其中之一是NF1基因第17外显子中的三碱基对的缺失(c.2970-2972 delAAT)导致单个氨基酸(p.Met992del)的丢失，这种基因的改变与相对轻微的NF1表型相关，其特征是出现咖啡色斑(CALS)和皮褶雀斑，无外部可见的皮肤丛状神经纤维瘤[18]。另外NF1中与基因-表型相关的是密码子p.Arg1809的错义突变，具有该特异性NF1突变的个体表现出CALS(可能有雀斑，可能无)和Lisch结节，但没有外部可见的丛状神经纤维瘤或皮肤神经纤维瘤[19]。然而，密码子p.arg1809的错义突变似乎非常罕见，因为在7000名已识别突变的NF1患者队列中，只有1.2%的患者观察到错义突变。在同一组患者中，同一种氨基酸缺失(p.Met992del)的发生率为0.8%[20]。

4 NF1高表型变异性原因

为了解释NF1的高表型变异性，科学家们给出了三类不同因素的作用。第一个因素是发生在NF1胚胎发育中或者更早(如父母体内配子发生)的突变性质。NF1中一个非常小的部分突变都与患者特定的体征有关，所以这表明，突变的性质并不是关键的决定因素[21]。第二个因素描述了一些特定已知的神经纤维瘤修饰物的存在，包括但不局限于遗传因子、性激素和肿瘤微环境[22]。第三个因素发生在细胞生长过程中的某一特定时间，与NF1基因的失活密切相关。NF1疾病患者只在他们身体的一小部分表现出来，最可能的解释是体细胞嵌合体，第一个NF1突变发生在胚泡和成神经细胞阶段之间的胚胎发育后期，这样一些细胞就可以存活下来，并保持NF1的野生型[23]。

5 NF1基因突变分析

NF1基因的突变率比大多数其他遗传疾病基因高10倍左右[24]。目前，在人类基因突变数据库(HGMD)中，已有超过2600种不同的NF1遗传突变点。被报道为是造成NF1疾病的原因，从跨越数个碱基大基因组的缺失到改变编码氨基酸或剪接位点功能的单碱基对替换，其突变大小各不相同[25]。虽然NF1突变谱明确定义为错义/无义(27.7%)，剪接(16.3%)，微缺失(26.9%)，微插入(11.1%)，总缺失(> 20 bp；13.3%)，总插入(> 20 bp；2.0%)，复杂重排(0.6%)等，但没有证据表明NF1内有任何局部的突变簇[26]。大多数(> 80%)的NF1突变后蛋白失活，基本会导致转录物或蛋白质的完全缺失。由于基因大小和结构较大，以及突变范围跨度大，患者中NF1突变的鉴定仍然很困难[27]。一直以来，使用互补组合方法鉴定了95%患者的基因突变位点，方法包括蛋白质截断实验，荧光原位杂交，异源双链DNA，Southern印迹杂交和细胞遗传学分析等[28]。一般初步的报告是通过测序检测NF1患者的样本，然后基于DNA的测序为临床诊断测试提供结论(见阿拉巴马大学伯明翰医学基因组实验室的网站)。因此，NF1突变分析有助于在临床中诊断不确定的NF1的病例[29]。