兔VX2骨肿瘤模型中IFN-γ、IL-4和PCNA的表达及关系

吕家兴 白磊鹏 曹海营 孔令伟 李哲宏 金 宇

VX2肿瘤起源于Shope病毒诱发兔外阴乳头状瘤衍生的鳞状细胞上皮癌，种植于兔骨骼可进行性破坏骨髓及骨皮质并出现骨膜反应，与人类恶性骨肿瘤生物学行为相似，对于研究恶性骨肿瘤的生长特性有极为重要的价值，目前已广泛应用于恶性骨肿瘤的动物实验研究[1]。辅助性T细胞(T helper cells，Th)在不同细胞因子的作用下可主要分为Th1和Th2两种亚群，Th1细胞亚群主要介导细胞免疫，分泌IFN-γ、IL-2等因子，Th2细胞亚群主要调节体液免疫,分泌IL-4、IL-10等因子[2]。PCNA称为周期性蛋白,可有效反映肿瘤细胞的增殖活性及判断肿瘤的恶性程度、侵袭性及转移能力，是目前公认的细胞增殖基因之一[3]。但目前关于IFN-γ、IL-4及PCNA在兔VX2骨肿瘤模型中的表达情况报道较少。因此，本研究采用酶联免疫吸附试验(enzyme linked immunosorbent assay,ELISA)进行定量分析，探讨兔VX2骨肿瘤模型外周血中IFN-γ和IL-4及骨肿瘤组织中IFN-γ、IL-4和PCNA的表达水平及三者之间的相关性。

材料与方法

1.实验动物、瘤系、仪器及试剂：30只日本大耳白兔，月龄3个月，均为雄性，体质量2.0～2.5kg，购自北京市昌扬西山养殖场，实验动物许可证号：SCXK(京)2016-0007，所有实验动物隔笼圈养，标准兔饲料及卫生水饲养,符合承德医学院动物饲养相关规定；VX2肿瘤购自重庆蒙博生物科技有限公司；X线检测机(OEC9800，美国GE公司)，光学显微镜(Olympus-BX53，日本Olympus公司)，全波长酶标仪(Multiskan FC，美国Thermo Fisher公司)；IFN-γ、IL-4及PCNA ELISA试剂盒购自河北瑞帕特生物科技有限公司。本实验动物使用流程已通过承德医学院附属医院机构动物护理与使用委员会的审查和批准，遵循医学伦理学要求。

2.制备VX2肿瘤组织块：取VX2荷瘤种兔1只，3%戊巴比妥(35mg/kg)经耳缘静脉注射麻醉后，取仰卧位固定于无菌操作台上，瘤区备皮消毒后逐层切开，将肿瘤组织完全去除，放置于磷酸盐缓冲液中，仔细去除周围纤维结缔组织及坏死组织，留取鱼肉状组织，在无菌条件下将肿瘤组织制备成1mm×1mm×1mm的组织块。

3.实验动物分组及构建动物模型：30只日本大耳白兔随机分为实验组和对照组，每组各15只。将30只日本大耳白兔经耳缘静脉注射3%戊巴比妥(35mg/kg)麻醉后，仰卧位固定于无菌操作台上，去除兔后肢毛发，常规消毒后，铺无菌孔单，选择胫骨内侧较平整处作1.5cm长切口，逐层切开皮肤、皮下组织显露胫骨，选用1.6mm克氏针垂直于胫骨内侧钻孔，钻入骨髓腔深度约1.5cm，实验组用顶棒将2～3块VX2肿瘤组织块置入骨髓腔，对照组不植入VX2肿瘤，骨蜡封堵植瘤孔，蒸馏水冲洗植瘤孔周围组织，丝线逐层缝合，碘伏消毒后无菌纱布包扎，家兔完全复苏后送回饲养笼，术后3天肌内注射抗生素预防感染。

4.外周血及组织ELISA检测：2组实验兔植瘤2周后抽取耳缘静脉血3ml，抽取血液于室温下静置待血清析出；实验组留取的肿瘤组织称重后加入磷酸盐缓冲液(1mg∶9ml)溶液并充分匀浆，均以2000r/min离心10min后收集上清液于-80℃低温冰箱冻存。所有上清液收集完成后严格按照ELISA试剂盒说明书进行检测IFN-γ、IL-4及PCNA的浓度。

5.胫骨X线及组织病理检查：植瘤后第1、2周行胫骨X线检查，观察肿瘤生长情况；两组实验兔采集外周血后经耳缘静脉空气栓塞法处死并切取肿瘤组织、植瘤孔周围软组织，观察肿瘤组织大体形态，予以10%甲醛溶液固定，石蜡包埋，切片经苏木精-伊红染色(hematoxylin-eosin staining，HE)，显微镜下观察组织病理学形态。

结 果

1.动物模型构建情况：2组实验兔在实验过程中无实验动物感染及死亡现象，处死后经病理证实肿瘤均种植成功。

2.IFN-γ、IL-4及PCNA表达水平：实验组外周血及肿瘤组织IFN-γ表达水平低于对照组(P<0.05)，外周血及肿瘤组织表达IL-4水平高于对照组(P<0.05)，实验组PCNA表达水平高于对照组(P<0.05,表1)。

组别 对照组实验组tP外周血IFN-γ(ng/ml)736.9±23.0698.0±33.0-3.7410.001外周血IL-4(ng/ml)158.2±16.4207.6±24.76.449<0.01肿瘤组织IFN-γ(ng/ml)782.5±33.6747.6±37.4-2.6860.012肿瘤组织IL-4(ng/ml)83.7±5.396.8±8.05.288<0.01肿瘤组织PCNA(ng/L)69.6±2.685.8±4.013.031<0.01

3.相关性分析结果：实验组外周血与肿瘤组织IFN-γ的水平呈正相关(r=0.737，P=0.002)，外周血与肿瘤组织IL-4的水平呈正相关(r=0.869，P<0.01)；外周血及肿瘤组织的IFN-γ与IL-4的水平呈负相关(r=-0.537，P=0.039；r=-0.812，P<0.01)。实验组外周血及肿瘤组织IFN-γ与肿瘤组织PCNA呈负相关(r=-0.604，P=0.017；r=-0.785，P=0.001)，外周血及肿瘤组织IL-4与肿瘤组织PCNA呈正相关(r=0.884，P<0.01；r=0.846，P<0.01)。

4.胫骨植瘤第1、2周X线检测：植瘤第1周肿瘤于髓腔内生长速度缓慢，破坏面积小；植瘤第2周肿瘤生长速度增快，髓腔破坏面积增大，可见骨皮质轻度破坏(图1)。

图1 实验组每周胫骨X线A.植瘤第1周；B.植瘤第2周；箭头示植瘤

5.胫骨大体观及病理检测结果：胫骨解剖纵切面可见鱼肉状VX2肿瘤位于胫骨上端，髓腔肿瘤增大但未见明显液化坏死(图2A)；病理结果显示低倍镜下可胫骨髓腔及骨质内肿瘤细胞呈浸润性巢状，呈片状分布，细胞排列紧密，细胞异型性大，周围软组织未见明显异常；高倍镜下可见肿瘤细胞大小不等、形态不一，胞界不清，核大，染色质丰富呈粗颗粒状，核仁明显，核分裂象多见(图2B～E)。

图2 胫骨大体观及肿瘤组织病理改变A.胫骨纵切面大体观；B.胫骨髓腔肿瘤细胞(HE，×40)；C.胫骨骨质肿瘤细胞(HE，×40)；D.胫骨骨质肿瘤细胞(HE，×100)；E.周围软组织(HE，×40)；箭头示植瘤

讨 论

合适的骨肿瘤动物模型对于研究骨肿瘤的生物学特性以及检验和改进骨肿瘤治疗新方式具有重要意义。在大鼠及小鼠上可诱发骨肿瘤，但该动物骨骼较小以及骨骼的矿化度高于人体骨，需特殊定制操作器械，导致操作结果无法与人体骨骼比较，同时也不利于骨的大体和微观骨形态观察。在猪、羊、犬等大型动物上由于目前不存在相匹配的骨肿瘤细胞系，同样不适合本研究的肿瘤模型制作[4]。而兔具有相对适中的骨骼，可使用与人骨骼相同的材料，并且骨的成分与密度与人骨骼相似，将VX2肿瘤直接移植于兔胫骨即可制作成兔VX2骨肿瘤模型，该模型制作简单、周期短、生物学性质稳定、成瘤率高，发生类似于人转移性骨肿瘤的溶骨性改变和骨膜反应，是目前研究恶性骨肿瘤较为理想的实验动物[5]。结合相关文献及本研究预实验结果，采用肿瘤组织块法构建兔VX2骨肿瘤模型2周内肿瘤生长稳定，在14～21天肿瘤组织因血供不足可发生液化性坏死并向周围组织浸润及远处转移，故本研究选择在植瘤后2周进行外周血及肿瘤组织ELISA检测，避免因肿瘤发生坏死或转移影响实验数据准确性[6]。

IFN-γ是Th1型细胞因子的关键因子，可活化T细胞、B细胞、自然杀伤细胞(natural killer clle，NK)和巨噬细胞，并促进其分化，上调P21受体的表达并促进Rb磷酸化，诱导G1期阻滞抑制肿瘤细胞增殖，与钙调磷酸酶B亚基发挥协同作用，促进肿瘤相关巨噬细胞向M1表型转化，增强巨噬细胞抗肿瘤活性，改善肿瘤微环境，并能诱导Th0细胞向Th1细胞分化，抑制Th2细胞及肿瘤细胞的增殖及分化，增强机体免疫的抗肿瘤能力[7～9]。IL-4是Th2最特异的细胞因子，能下调Th1细胞的抗肿瘤免疫反应，抑制Th1分泌IFN-γ，使IFN-γ对NK细胞的活化作用及细胞毒性T淋巴细胞(cytotoxic T lymphocyte，CTL)对肿瘤抗原的识别能力降低，使肿瘤细胞可逃避特异性CTL的杀伤作用，还能直接作用于CD8+T细胞，降低其对肿瘤细胞的毒性，增加调节性CD4+T细胞和髓系来源的抑制细胞，并对肿瘤相关巨噬细胞增殖起重要作用，促进M2巨噬细胞等抑制免疫细胞的产生[10,11]。

本研究中实验组外周血及肿瘤组织IFN-γ表达水平较对照组下降，IL-4表达水平较对照组上升(P<0.01)，而胫骨X线显示植瘤第2周髓腔破坏面积明显大于植瘤第1周，病理结果显示植瘤第2周肿瘤向骨皮质浸润，笔者认为可能是植入VX2肿瘤后机体的抗肿瘤免疫反应未被完全抑制，IFN-γ会抑制肿瘤细胞增殖，但随着VX2肿瘤于兔体内植入时间的延长，VX2肿瘤会以自分泌的方式产生大量IL-4以及通过肿瘤细胞上的IL-4受体介导肿瘤细胞的增殖，IL-4的表达水平增加会抑制抗原呈递作用，抑制IFN-γ的增殖及Th1细胞分泌IFN-γ，IFN-γ的减少会降低对CTL及NK细胞的活化作用，介导机体的细胞毒效应降低，并且IL-4会诱导更多的Th0细胞向Th2细胞分化，抑制Th0细胞向Thl细胞分化，机体肿瘤免疫调节受到抑制，肿瘤增殖及浸润能力增强[12，13]。

PCNA表达水平的高低可提示肿瘤细胞增殖是否活跃，客观反映肿瘤生物学特性及生长状态[14]。PCNA在细胞内的变化存在周期性，在静止期G0～G1期表达不明显，G1晚期开始表达，到S期达到高峰，在G2/M期明显下降，并且是DNA聚合酶δ的辅助蛋白及DNA复制必需的组分，在细胞增殖时参与协调DNA前导链和后随链的合成，是DNA增殖的重要调控因子[15，16]。本研究结果显示，构建兔VX2骨肿瘤模型2周后实验组肿瘤组织PCNA表达水平高于对照组(P<0.01)，结合胫骨X线及病理结果表明PCNA可反映VX2骨肿瘤的生长情况，也间接佐证了VX2肿瘤作为一种恶性程度较高、复制能力较强的鳞状细胞肿瘤，降低了模型制作时间，是一种理想的骨肿瘤模型。

细胞异常增殖和细胞间生长相互抑制的失衡是导致肿瘤发生、发展的重要因素，而肿瘤免疫调节的抑制会导致肿瘤细胞的增殖及发生转移[17]。本研究中IFN-γ与IL-4、PCNA呈负相关，IL-4与PCNA呈正相关，说明IL-4与PCNA可能在VX2骨肿瘤发生、发展中具有促进作用，IFN-γ抑制肿瘤增殖的作用可能受到影响。笔者认为出现这种情况是因为IFN-γ可上调P21受体的表达并促进Rb磷酸化，诱导G1期阻滞抑制肿瘤细胞增殖，并能诱导肿瘤细胞凋亡，但肿瘤细胞可通过自分泌形式分泌IL-4以及生成IL-4受体，诱导Th0细胞向Th2细胞分化增加，Th1细胞减少，使IFN-γ的表达水平降低，导致IFN-γ抑制肿瘤增殖及促进肿瘤凋亡的功能降低[18]。并且随着IFN-γ表达水平的降低，在肿瘤细胞增殖G1期的抑制作用减弱，PCNA在G1期的表达会呈上升趋势，进一步增强了VX2肿瘤的增殖及复制能力，肿瘤细胞分泌的IL-4不断增加使IFN-γ的表达水平不断降低[19，20]。

综上所述，兔VX2骨肿瘤模型增殖迅速，恶性程度高，导致IFN-γ表达水平的降低及IL-4、PCNA表达水平的上升，机体肿瘤免疫功能抑制肿瘤增殖及促进凋亡的作用降低，肿瘤生长速度及侵袭性不断增强。因此，检测IFN-γ、IL-4及PCNA的表达水平并协同分析有利于分析该动物模型的肿瘤免疫调节及肿瘤增殖情况，为今后以兔VX2骨肿瘤模型为载体进行相关治疗研究时验证其治疗效果提供依据。