滤泡辅助性T细胞相关表达分子在慢性乙型肝炎患者中的表达及意义

梁淑慧 黄燕晓 朱 晔 时 光 庞志宇 黎家希 周迎春

滤泡辅助性T细胞(T follicular helper cells, Tfh)是一种高表达趋化因子受体5(C-X-C chemokine receptor type5,CXCR5)的新型CD4+T淋巴细胞亚群，其在B淋巴细胞趋化因子(CXCL13)的趋化下使细胞定位于淋巴滤泡，进而对B淋巴细胞增殖、分化，诱发体液免疫和长寿命浆细胞的形成提供帮助。研究证实Tfh细胞过表达在自身免疫性疾病、免疫缺陷性疾病以及肿瘤的发生、发展有重要的关系[1～3]。对于病毒感染性疾病，也有研究发现Tfh细胞与CHB患者的高球蛋白血症有关, 也与CHB患者的免疫活性状态有关[4，5]。本研究旨在探讨CHB患者外周血Tfh细胞相关表达分子CXCR5、CXCL13、IL-21和人转化生长因子β2(TGF-β2)的表达水平及其与病毒学、血清学和生化指标的关系，分析其在CHB发生、发展中的作用。

对象与方法

1．研究对象：(1)选取2018年10月～2019年3月笔者医院就诊的门诊或病房CHB患者共50例为患者组，其中男性29例，女性21例，患者年龄20～65岁，平均年龄37.74±11.63岁，诊断符合慢性乙型肝炎诊断标准(2015年版)，同时排除合并甲、丙、丁、戊型等病毒性感染，以及药物性肝炎、酒精性肝炎、脂肪肝等其他肝炎。(2)选取来笔者医院体检中心做体检的健康人群共30例为对照组，其中男性17例，女性13例，年龄20～60岁，平均年龄35.80±12.42岁，既往体健。

2．方法：(1)所有入组对象均知情同意后留取空腹血4ml，离心分离血清，置于-70℃冷藏待用。(2)采用ELISA定量检测试剂盒(上海一基实业有限公司)分别测定CHB患者组和对照组CXCR5、CXCL13、IL-21和TGF-β2，严格按操作说明进行，在ELX808酶标仪(美国BIO-RAD公司)上比色，计算定量结果。(3)采用荧光定量PCR仪Roche LightCycler 480(瑞士Roche公司)及其配套试剂测定HBV DNA载量。(4)采用全自动免疫分析仪ARCHITECT i4000(美国Abbott公司)及其配套试剂测定HBsAg和HBeAg，HBsAg<0.05IU/ml判为阴性，HBeAg≥1.0S/CO值判为阳性。全自动生化分析仪Cobas C 701(瑞士Roche公司)及其配套试剂测定AST和ALT。

结 果

1.CHB组与对照组HBV DNA、HBsAg、ALT和AST等指标比较：CHB组HBV DNA、HBsAg显著升高，对照组HBV DNA载量及HBsAg均为阴性。CHB组ALT、AST较对照组升高，两者比较差异有统计学意义(P<0.05),详见表1。

2.CHB组与对照组外周血Tfh细胞相关表达分子分析：CHB组CXCL13、CXCR5、TGF-β2和IL-21均明显高于对照组，差异有统计学意义(P<0.05)，详见表2。

表1 两组HBV DNA、HBsAg、ALT和AST等指标比较

表2 两组外周血CXCL13、CXCR5、TGF-β2和IL-21的比较

3.CHB组Tfh细胞相关表达分子与临床指标的相关性分析：CHB组的CXCL13、CXCR5、TGF-β2、IL-21与HBV DNA、HBsAg、AST、ALT之间均无相关性(P>0.05)，详见表3。

表3 CHB组Tfh细胞相关表达分子与临床指标的相关性

4.HBeAg阳性组与HBeAg阴性组Tfh细胞相关表达分子的表达差异：HBeAg阳性组与HBeAg阴性组CXCL13、CXCR5、TGF-β2和IL-21表达均明显高于对照组，差异有统计学意义(P<0.05)。HBeAg阴性组的CXCL13、CXCR5、TGF-β2和IL-21表达均高于HBeAg阳性组，但差异无统计学意义(P>0.05)，详见表4。

项目对照组HBeAg阳性组HBeAg阴性组CXCL13(ng/ml)2.24±0.755.16±1.17∗5.32±0.87∗CXCR5(ng/ml)2.64±0.585.31±0.66∗5.41±0.62∗TGF-β2(pg/ml)1642.76±551.235800.31±1349.35∗6065.38±638.13∗IL-21(pg/ml)208.73±87.232295.39±624.08∗2311.39±387.81∗

讨 论

Tfh细胞定位于淋巴滤泡生发中心，可持续的表达CXCR5和高水平的诱导性协同刺激分子(inducible costimulator，ICOS)及程序性死亡分子-1(programmed death 1,PD-1)，产生效应因子IL-21，B细胞淋巴瘤转录因子-6(B cell lymphoma transcription factor-6,Bcl-6)是其分化发育的关键转录因子[6,7]。效应Tfh细胞与高亲和力B细胞的相互作用促进了生发中心的形成和维持，促使B细胞增殖、抗体类别转换以及分化成为浆细胞和记忆性B细胞，导致某类高效价自身抗体的产生，机体体液免疫应答发生紊乱，因此，Tfh细胞功能正常与否是决定机体抗体免疫应答发生的主要因素[8～11]。

IL-21 是Tfh细胞执行效应功能的主要细胞因子。在人和小鼠中，IL-21 是诱导浆细胞分化的重要细胞因子，可诱导 B 细胞分化为免疫球蛋白分泌细胞分泌相应的免疫球蛋白[12]。Tfh细胞本身也表达 IL-21R，IL-21可诱导Tfh细胞分化，促进其表面 CXCR5、ICOS 的表达。Tfh 及淋巴器官的其他细胞，如基质细胞、树突状细胞和B细胞本身都可以产生一定量的TGF-β2。TGF-β2协助IL-21促进初始B细胞增殖和分化。IL-21促使B细胞发生IgG抗体类别转换，而TGF-β2则协同IL-21发生IgA抗体类别转换。Tfh及其细胞因子IL-21和TGF-β2具有辅助B淋巴细胞增殖、成熟、发生抗体类别转换的作用[13]。本研究主要检测了外周血中Tfh细胞的表面标志分子CXCR5、CXCL13以及效应因子IL-21、TGF-β2的含量。

本研究发现，CHB患者外周血中CXCR5和其配体CXCL13表达水平明显高于健康对照组，提示HBV感染人体后可引起Tfh细胞增殖，从而使外周血中CXCR5、CXCL13表达增加，并参与了 HBV 所介导的免疫反应。本研究中CHB组外周血中Tfh细胞分泌的细胞因子IL-21和TGF-β2表达水平明显高于健康对照组，表明HBV感染人体后引起Tfh细胞分泌IL-21增多，进一步诱导浆细胞的分化，分泌更多相应的免疫球蛋白，同时通过Tfh细胞自身表达的IL-21R，也可诱导Tfh细胞分化，促进其表面 CXCR5、ICOS的表达[14]。TGF-β是一种多功能的细胞因子，可以调节多种细胞的生长、分化及凋亡等，也可促进细胞外基质合成[15]。TGF-β可分为TGF-β1、TGF-β2和TGF-β3，有研究表明TGF-β2有诱导晶状体上皮细胞凋亡、促进骨髓间充质干细胞成骨分化，辅助B淋巴细胞增殖，成熟，发生抗体类别转换等作用[13,16,17]。本研究中CHB组外周血TGF-β2表达水平明显增高，说明HBV感染人体后刺激机体细胞产生更多的TGF-β2，增多的TGF-β2和IL-21协同作用促进初始B细胞增殖和分化，发挥机体免疫应答以及清除病毒的作用。

Hu等[14]研究发现,CHB患者外周血CD4+CXCR5+Tfh细胞及IL-21的表达显著上调，并且与ALT和AST的水平呈正相关，但与HBV-DNA载量无相关性。李凤惠等[18]研究发现，CHB组Tfh细胞百分比高于HBV携带者。外周血CD4+CXCR5+Tfh占CD4+T 淋巴细胞的比例与 HBV DNA 载量呈负相关。也有研究发现CHB患者不同免疫分期的Tfh表达比较差异无统计学意义，HBsAg、HBeAg、HBV DNA水平与CD4+ICOS+CXCR5+亦未发现有相关性。可见对CHB患者Tfh细胞是否与肝脏炎症程度及病毒载量高低有关研究不一。本研究对CHB组的HBsAg、HBV DNA、AST、ALT水平均分别与CXCL13、CXCR5、TGF-β2和IL-21进行相关分析，结果显示,IL-21、CXCR5、CXCL13与HBV DNA、HBsAg、AST、ALT、HBV DNA之间均无明显相关性，与Hu等[14]及王燕等[19]的研究基本相似，提示在CHB患者中Tfh细胞参与机体免疫应答，但与HBV DNA量的多少无关。

本研究将CHB患者中HBeAg阳性者与HBeAg阴性者的CXCR5、CXCL13、IL-21和TGF-β2含量进行比较，结果显示HBeAg阳性组与HBeAg阴性组CXCR5、CXCL13、IL-21和TGF-β2表达均明显高于健康对照组，差异有统计学意义(P<0.05)，而HBeAg阴性组的CXCR5、CXCL13、IL-21和TGF-β2表达均高于HBeAg阳性组，但两者比较差异无统计学意义。有研究发现在治疗中获得HBeAg 血清学转换组的IL-21和IL-17 水平显著增高。可能是免疫激活期肝脏炎症活动活跃时Tfh细胞的高表达，有利于启动自身体液免疫系统，诱导B细胞分泌抗体，从而帮助实现HBeAg的血清学转换，但本研究中患者个体基础情况差异大，存在不同程度的免疫失调，且接受的治疗可能不一致，两组比较差异无统计学意义，有待于扩大样本量进一步研究。

综上所述，本研究显示在CHB患者中，Tfh细胞及其功能相关分子IL-21和TGF-β2参与了HBV感染后相关的免疫应答反应，可以作为不同免疫状态下免疫损伤的预测指标，为慢性乙型肝炎的免疫治疗提供新思路。