流感检测方法研究进展

2020-12-24古丽米娜

世界最新医学信息文摘 2020年49期

关键词：流感病毒抗原定量

古丽米娜

（新疆塔城地区疾病预防控制中心，新疆塔城 834700）

0 引言

本文着重介绍了在流感检测中常用的分子检测技术包括实时荧光定量PCR技术和免疫学检测技术。

1 分子检测技术

近年来，分子生物学的研究取得了长足的进步，流感病毒的检测技术变得更加成熟和多样化。除纳米技术，核酸探针技术，基因测序技术，原位杂交技术，质谱法等外，本文主要介绍了聚合酶链反应检测，核酸序列依赖性扩增，环介导的等温扩增和基因芯片检测技术。目前在中国预防和监测流感病毒中使用最广泛的是聚合酶链反应检测方法。

1.1 聚合酶链反应。通过聚合酶链反应（PCR）检测流感病毒主要是通过分子生物学检测技术实现的，该技术是通过在很短的时间内添加大量特异性DNA片段实现对病毒的检测。在具体的检测过程中，聚合酶链反应只需要少量样品就可以实现对流感的检测。并且重复性好，检测速度快，灵敏高效。从收集样本到最终检测结果至少需要2个小时，最多需要24个小时。聚合酶链反应方法包括常用的RT-PCR方法，多重RT-PCR方法和实时荧光定量方法。其中，常见的RT-PCR方法主要检测NA基因片段和HA基因片段，目前检测未知流感。通过合并引物对病毒的基因片段进行扩增，以达到分型的目的。多重RT-PCR方法一次只能检测一种病毒，也可以同时检测多种病毒，但是必须应用多对引物组合来进行类型检测。它还具有高灵敏度和特异性，高检测效率以及用于检测多种病毒的低成本夜店，所以更适合于临床检测应用。实时荧光定量检测方法是将荧光基因添加到聚合酶链反应系统中，并通过在检测过程中实时积累荧光信号进行检测，从而进行定量分析。该方法不仅具有普通聚合酶链反应方法的特异性强，灵敏度高和可重复性的优点，而且由于可以更直观地检测荧光因子，因此大大降低了检测假阳性的可能性。

1.2 依赖核酸序列的扩增法（NASBA）。依赖核酸序列的扩增方法的检测敏感性和特异性高于通过聚合酶链反应检测的方法。并且扩增效率更高并且操作相对简单。但是，该方法必须在检测之前优化引物。也有一些病毒在检测病毒时出现假阳性或敏感性不足。它主要由一对引物引导连续的特异性单链RNA进行恒定温度扩增以产生反应。依靠核酸序列的扩增方法被广泛用于流感病毒检测和呼吸道病毒检测。目前，医学研究界改进了NASBA检测技术。目前NASBA检测技术已经可以实现实时检测和定量检测。大大提高了其检测的特异性和灵敏度。它已被广泛用于检测甲型和乙型流感病毒和呼吸道病毒，并可以快速分离出乙型，H3N2和H1N1流感病毒[1]。

1.3 环介导等温扩增法（LAMP）。环介导等温扩增法（LAMP）是一种扩增核酸的方法。具体方法是将四种特异性引物与恒定温度下的DNA聚合酶的置换结作用，实现靶基因上多个区域的核酸扩增。该方法操作简便，不需要特殊的试剂和仪器。LAMP检测只有两个结果，一个是扩增，另一个是没有扩增，只需要检查反应物的颜色和试剂的浊度即可判断结果。目前，LAMP技术已经非常成熟，并开发了多种针对性的检测技术，如新型H1N1流感病毒检测技术的检测，季节性流感病毒的检测技术，H3N2病毒的检测技术[2]。

1.4 基因芯片。其测序原理是一种杂交测序方法，通过与一组已知的核酸探针杂交来确定核酸序列。并将具有已知序列的靶核苷酸的探针固定在基片表面上。通过将探针与样品杂交并检测杂交信号来确定生物样品的数量。基因芯片检测的稳定性高，重复性和并行性好，检测速度快，效率高。唯一的缺点是操作繁琐，特别是对于测试设备和其他条件的要求较高，难以适用于一般实验室的病毒检测。但对于调查流行病学和进行医学科学研究非常有效[3]。

2 实时荧光定量PCR技术

检测流感病毒的最常见方法通常是分离病毒和鉴定病毒。细胞培养的方法可用于分离流感病毒，从而确保流感病毒与原始标本的抗原性处于一致状态，这对于长期保存以及更好地分析病毒抗原性和基因是有利的。然而，细胞培养方法存在一些缺陷，主要是因为从其中分离出的病毒不能用于疫苗生产，并且细胞培养方法的检测率容易受到待检测病毒载量样品的质量影响。如果样品质量不够高或病毒载量不足，则容易产生假阴性的情况。

同时，细胞培养方法适用于对活体病毒的检测，因此该检测方法需要在收集和保存标本的过程中确保病毒的活性。实时荧光定量PCR是传统PCR技术不断发展出的一类新技术，可以实时监控核酸的拷贝数。这一技术具有高灵敏度和快速检测速度的特点。在检测过程中受到污染的影响，检测结果比较精准。已广泛用于病毒病原体的检测[4]。

聚合酶链反应（PCR）可用于扩增特定核苷酸片段的指数级数。在扩增反应发生后，对扩增产物进行凝胶电泳定性分析，可以使用放射性核素进行标记后使用光密度扫描。并采取定量分析措施进行相关的检测任务。实时定量PCR主要是实现实时检测PCR扩增反应当中的每一个循环产物的荧光信号。在此过程中，从最初的模板到最后的信号收集都要进行定量和定性分析，实时荧光定量PCR反应产物将继续进行。随着荧光信号数量的增加，荧光信号的强度也会增加。在每个循环中，都能收集到各个循环的荧光信号强度。从而可以根据荧光强度的变化观察产物量的变化，从而绘制荧光扩增曲线图。用于提取病毒RNA的实时荧光定量PCR检测法的检测方法耗时约3小时，并且对流感病毒具有高特异性。与血清诊断和特异性抗体检测相比，实时荧光定量PCR检测法可以鉴定多种流感病毒株，并且特异性和敏感性都较高，这有助于尽快诊断出此类患者的具体疾病[5-6]。

3 病原学检测方法

3.1 病毒分离与鉴定。分离和鉴定病毒是对流感的经典诊断方法。最常用的方法是细胞接种和鸡胚接种。根据细胞源性病变，鸡胚死亡或培养的尿囊液具有凝集性红细胞的特征作为判断的基础进行鉴定。针对NP的单抗体，也可以用于通过免疫荧光染色对病毒进行初步鉴定。诊断还需要其他辅助测试方法。这一测试方法的结果准确，可靠，敏感。但是，操作过程复杂，成本高，实验室要求高，费时费力，周期长，检测时间需要1-3周，对于大面积的应用受到了相当的限制。

3.2 电镜检测技术。流感病毒可以通过电子显微镜或免疫电子显微镜诊断。在电子显微镜下可以清楚地观察到病毒的形态，以确定病毒的存在与否。电子显微镜检测快速，准确，但测试结果与样品制备技术，取材位置和时间有关。而且该方法不能用于确定亚型和致病性。

4 免疫学检测

4.1 血凝（HA）和血凝抑制（HI）试验。HA和HI检测简单，快速，但操作繁琐且耗时，并且无法用已知HA亚型的抗血清检测出新的流感HA亚型。HI检测是WHO在全球流感监测中使用的一种流行方法。通常首先将可疑疾病材料接种到适当年龄细胞中以进行病毒分离，然后使用培养物检测培养物是否具有血凝素活性，然后使用已知的阳性抗体进行HI试验血清验证。

4.2 琼脂扩散试验（AGP）。AGP测试用于检测甲型流感病毒特异性血清抗体，适用于鉴定所有甲型流感病毒。AGP测试很简单，可以定性和定量检测。但是，这一方法灵敏度差并且容易产生假阳性。已经基于AIV快速定型双扩散法建立了AGP诊断试剂盒。

4.3 乳胶凝集试验（LAT）。LAT是一种聚苯乙烯乳胶颗粒，可作为吸附特定抗原或抗体的载体。当遇到血清中的相应抗体或处理过的材料中的相应抗原成分时，会形成较大的聚集颗粒。乳胶凝集试验简单，快速，不需要昂贵的设备和操作技能。由于被LAT识别的IgM抗体是人体产生最早的一种抗体，因此LAT更适合早期诊断。

4.4 神经氨酸酶抑制试验（NIT）。神经氨酸酶抑制试验基于甲型流感病毒表面抗原神经氨酸酶的特征来鉴定流感病毒。Van Deuson R A等人改进了恒定NIT测试方法，以建立平板微NIT方法。该方法不仅减少了抗原的数量，而且同时对多个分离株进行处理。世界卫生组织已推荐该方法用于神经氨酸酶亚型的分类。

4.5 病毒中和试验（NT）。NT检测是最经典的血清学方法之一。只有当抗体与病毒体上的表面抗原相对应时，特别是当抗体与吸附在宿主细胞上的病毒抗原相对应时，测试才能获得令人满意的结果。因此，NT检测是最灵敏，最特异性的血清学检测方法，检出率也很高，但操作繁琐，耗时。

4.6 免疫荧光技术（IFA）。免疫荧光法是在抗体上标记不影响抗原抗体活性的荧光染料，并在与相应的抗原结合后在荧光显微镜下表现出特定的荧光反应的方法，包括直接荧光抗体方法和间接荧光抗体方法。后者更为常见。IFA是剧透高度特异性和敏感性的，可用于鉴定和定位感染流感病毒的细胞中的特定抗原，主要是核蛋白和基质蛋白抗原。然而，抗原的制备需求较高高，结果判断的客观性不足，并且假阳性的发生概率高，因此，这仅仅只能作为一种筛选方法使用。

4.7 酶联免疫吸附试验（ELISA）。ELISA法运用酶标记抗原或抗体，并通过显色反应检测相应的抗体或抗原，并且可以进行定性和定量确定。ELISA方法的灵敏度和特异性与被包被的抗原或抗体的纯度直接相关，高于常规方法的AGP测试和HAI测试，并且检测需要的时长也更短。可以实现抗原检测和抗体检测。目前，已经建立了流感病毒重核蛋白ELISA方法和流感抗体斑点ELISA（Dot-ELISA）检测方法[7-8]。

4.8 侧流免疫测定（LFA）。LFA技术的检测原理是乳胶珠或胶体金的抗原-抗体复合物横向迁移，直到在固定表面（膜支持物）上遇到抗体为止，结合后可以通过肉眼观察到一系列的反应。LFA具有快速分析的优势，可用于现场检查。

4.9 胶体金免疫层析法（GICA）。GICA使用免疫层析原理将抗原或单克隆抗体固定在层析介质上。通过毛细管脉冲使待测样品的抗原或抗体脉冲化，然后在结合后保留在该区域中，并根据胶体金法官进行免疫色谱反应。GICA是一种快速简便的方法，可在15～30分钟内获得诊断。它具有不需要实验设备，可用视觉判断，试剂用量少，稳定性强和重复性好，特异性强的优点。适用于现场快速初步筛选。缺点是对流感的检测灵敏度低，易漏检或出现假阳性，不易量化，不便于大规模的密集操作[9-10]。

4.10 压电生物传感器检测仪。该技术采用戊二醛交联法，将流感H抗原固定于银电极表面，制成多通道的压电免疫传感器，判定标准为检测阳性样品的响应值与阴性样品的噪声值之比＞3，可用于AIV的定性定量检测。生物传感器灵敏度高、响应快，不需要标记，可同步进行流感病毒的定性定量和分型诊断检测，具有高灵敏度、小体积、快速、低成本、便于携带等优点。