乙型病毒性肝炎与原发性胆汁性胆管炎患者血清抗线粒体抗体M2亚型表达的特征分析

赵 敏,李勤光，卓传尚（福建医科大学孟超肝胆医院检验科，福州 350025）

抗线粒体抗体（AMA)是一种无种属特异性也无器官特异性的自身抗体由MAOKEY 等于1958年首次发现于原发性胆汁性肝硬化（primary biliary cirrhosis,PBC)患者血清中，根据靶抗原的不同可以分为M1 ～M9 几种亚型。其中抗线粒体抗体M2亚型（AMA-M2）为诊断PBC 的特异性抗体，相关报道表明AMA-M2 可见于95%的PBC 病人，敏感度可达90%[1]。有多个文献报道[2-4]乙型病毒性肝炎患者中亦可出现AMA-M2 亚型的表达，LI 等[5]报道325 例慢性乙肝病人中有6.8%的患者检测到AMA-M2 抗体。由于AMA-M2 阳性对临床诊断PBC 的倾向性较明显，目前临床上M2 阳性乙型病毒性肝炎患者常需要进行肝组织穿刺活检来鉴别诊断是否并发PBC。然而，肝组织穿刺活检是一种侵入性操作，少数病例可发生严重的并发症乃至死亡，其次肝穿刺采样仅为肝脏质量的五万分之一，存在一定的采样误差。因此需要其他无创方法替代或弥补肝穿刺组织活检的不足。由于慢性乙型肝炎和PBC 的发病机制不同，因此二者免疫学和生化特征可能亦有差别。本文回顾性分析174 例AMA-M2阳性慢性乙型肝炎和PBC 病人的免疫学指标和血清生物化学特征，为临床AMA-M2 阳性慢性乙型肝炎和PBC 的鉴别诊断提供可能的新依据。

1 材料与方法

1.1 研究对象 收集2015年1月～2018年6月期间在福建医科大学孟超肝胆医院就诊的174 例M2阳性肝功能异常病例，包括单纯乙型病毒性肝炎，原发性胆汁性胆管炎(PBC)和乙型病毒性肝炎合并PBC 等。PBC 诊断依据2015年中华医学会分会PBC 诊断指导建议[6]，乙型病毒性肝炎诊断符合《慢性乙型肝炎防治指南》（2015年更新版）[7]。乙型病毒性肝炎并发PBC 诊断依据乙肝诊断标准外，均结合肝活组织病理检查来确诊。

1.2 试剂与仪器 自身抗体检测使用欧蒙（杭州）医学诊断实验公司自身抗体IgG 检测试剂盒，亚辉龙自身免疫性肝病抗体普检测试剂盒，亚辉龙全自动免疫印迹分析仪(Tenfly Auto)，奥林巴斯荧光显微镜（BX51)；生化指标检测使用贝克曼公司AU5800 全自动生化分析仪及配套检测试剂盒。

1.3 方法

1.3.1 AMA-M2 检测：使用亚辉龙全自动免疫印迹分析仪及配套的自身免疫性肝病抗体谱检测试剂盒，加样后仪器自动进行样本的孵育、洗涤、加液、烘干、结果扫描、输出。结果判读依据试剂说明书，M2 条带着色浅于临界质控条带则判断为阴性，在临界质控条带与阳性条带之间则判断为弱阳性，大于阳性条带则判断为阳性。

1.3.2 抗核抗体检测：使用德国欧蒙间接免疫荧光法检测试剂盒，选用HEP-2，鼠肾、猴肝、鼠胃四种基质。待测血清自1∶100 起稀释并按试剂说明书操作后在荧光显微镜下进行判读抗核抗体（ANA)核型、抗线粒体抗体、抗平滑肌抗体及其相应的滴度。

1.3.3 肝功能、血脂等生化指标检测： 应用贝克曼公司AU5800 全自动生化分析仪及配套检测试剂检测丙氨酸氨基转移酶（ALT）、天门冬氨酸氨基转氨酶（AST）、γ-谷氨酰转肽酶（GGT）、碱性磷酸酶（ALP）、总胆汁酸（TBA）、三酰甘油（TG）、总胆固醇（TC）、高密度脂蛋白（HLD）和低密度脂蛋白（LDL）。

1.3.4 免疫球蛋白IgG,IgM 抗体检测：使用西门子公司全自动蛋白分析仪（BNⅡ)及配套检测试剂盒。

1.4 统计学分析 采用SPSS21.0 软件进行统计学处理。生化、免疫球蛋白等非正态分布计量资料以中位数(P25～P75)来描述，使用非参数秩和检验进行对比分析；计数资料以例数和百分比来描述，使用卡方检验进行对比分析；ANA 和AMA 阳性率及滴度分布属于单向有序等级资料，采用秩和检验，P＜0.05 为差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 AMA-M2 阳性各组患者的一般资料与生化指标检测结果 见表1。37 例单纯乙型病毒性肝炎（乙肝组），129 例PBC（PBC 组）和8 例乙型病毒性肝炎并发PBC（乙肝并发PBC)。乙肝组男女患者比例为1.46∶1，PBC 组和乙肝并发PBC 组男女比例分别为0.23∶1 和0.14∶1。经两两比较PBC 组与乙肝组之间男女构成比差异有统计学意义（χ2=23.95，P＜0.01）。三组间年龄分布差异无统计学意义。

除总胆汁酸（TBA）和IgG 抗体外，三组患者血清生化指标和免疫球蛋白水平的差异均有统计学意义（均P＜0.05）。进一步两两比较分析显示，乙肝组的血清ALT 水平高于PBC 组，差异有统计学意义（U=1 826.5，P＜0.05），AST 水平高于PBC 组但差异无统计学意义。PBC 组血清GGT，ALP，TG，TC，HDL 和IgM 等水平高于乙肝组，差异均有统计学意义（U 分别为1 210.0，1 608.0，1 830.5，1 244.5，1 678.5 和717.5，均P＜0.01）。PBC 组与乙肝并发PBC 组ALT, AST 水平差异具有统计学意义（U=253～281,均P＜0.05)。

表1 AMA-M2 阳性三组患者一般特征及生化指标检测结果[(±s),M(P25～P75)]

表1 AMA-M2 阳性三组患者一般特征及生化指标检测结果[(±s),M(P25～P75)]

注：*PBC 组与乙肝组相比P＜0.05,**PBC 组与乙肝组相比P＜0.01；▼乙肝组与乙肝并发PBC 组相比P＜0.05,▼▼乙肝组与乙肝并发PBC 组相比P＜0.01;▽PBC 组与PBC 并发乙肝组相比P＜0.05。

项目 PBC 组（n=129） 乙肝组（n=37） 乙肝并发PBC 组（n=8） χ2/F P性别（男/女） 24/105 22/15 1/7 25.23 ＜0.001年龄（岁） 55.46±10.34 50.54±13.46 58.75±17.18 2.02 0.111 GGT（U/L) 217（95～501）** 80（48～159)▼▼ 258（141～304.5） 2.31 ＜0.001 ALT(U/L) 59（32～106）* 101（39～218)▼ 29（20～49）▽ 9.46 0.009 AST(U/L) 74（42～113） 83（45～226)▼ 37.5（23.5～62.5）▽ 8.41 0.015 ALP(U/L) 225（141～353）** 144（103～235) 146（103.5～198） 1.23 0.001 TBA(μmol/L) 30.5（10.5～140.5） 22（11.8～105.9） 10.9（6.7～70.35） 3.01 0.222 TG(mmol/L) 1.3（0.9～1.9）* 1.06（0.81～1.43） 1.16（0.97～1.73） 4.82 0.09 TC(mmol/L) 5.53（4.19～7.03）** 3.87（2.69～4.61） 4.9（3.71～5.59） 20.85 ＜0.001 HLD(mmol/L) 1.22（0.72～1.79）* 0.93（0.29～1.26） 1.16（1.03～1.33） 7.80 0.020 LDL(mmol/L) 2.49（1.93～3.39）** 1.9（1.47～2.43） 2.34（2.11～2.87） 9.95 0.007 IgM(g/L) 3.36（2.26～4.11）** 1.34（1.09～1.56）▼▼ 2.96（2.38～3.47） 42.00 ＜0.001 IgG(g/L) 16.5（13.9～20.1） 16.9（13.3～22.4） 18.75（16.55～24.25） 1.55 0.459

2.2 AMA-M2 阳性各组患者M2 弱阳性与阳性构成比比较 见表2。PBC 组、乙肝组和乙肝并发PBC 组间的M2 弱阳性与阳性构成比差异具有统计学意义（χ2=57.154，P＜0.001),乙肝组M2 抗体以弱阳性为主（70.3%），PBC 组与乙肝并发PBC 组以阳性为主（88.4%，100%）。

表 2 三组间M2 抗体弱阳性与阳性构成比[n(%)]

2.3 AMA-M2 阳性各组患者抗核抗体（ANA）阳性率及滴度分布 见表2。AMA-M2 阳性的PBC、乙肝和乙肝并发PBC 的ANA 阳性率分别为98.45%（127/129）、67.57%（25/37）和100%（8/8)，差异有统计学意义（χ2=28.421，P＜0.001）。三组间ANA 滴度分布差异有统计学意义（χ2=112.28，P＜0.001），PBC 组和乙肝并发PBC 组ANA 高滴度(≥1:320)比率分别为98.4%（125/127）和100%（8/8），均高于乙肝组的48%（12/25），差异均有统计学意义（U 值分别为22.0，367.0，均P＜0.01）。

表3 三组间抗核抗体（ANA）阳性率及滴度[n(%)]分布

2.4 AMA-M2 阳性各组患者抗线粒体抗体(AMA)阳性率及滴度分布 见表4。AMA-M2 阳性的PBC，乙肝和乙肝并发PBC 的总AMA 阳性率分别为93.02%，21.62%和100%，差异有统计学意义（χ2=14.575，P=0.001）。此外，三组间AMA 滴度比较差异有统计学意义（χ2=104.37，P＜0.001)。两两比较显示PBC 组和乙肝并发PBC 组AMA 滴度分布差异均无统计学意义（U=0.020，P=0.888），但均高于乙肝组（U 值分别为6.50 和283.5，均P＜0.01）。

3 讨论

慢性HBV 感染的发病机制较为复杂，迄今尚未阐明，普遍观点认为HBV 病毒引起的免疫应答是造成肝细胞损伤及炎症坏死的主要机制[6,8]。并有多个报道表明可在乙肝患者中检测到多种自身抗体，包括AMA-M2[9-10]。AMA-M2 抗体是诊断原发性胆汁性胆管炎（PBC）的特异性指标。因此乙肝患者中检测出AMA-M2 常给临床诊断造成困扰。文献推测乙肝患者中检测出AMA-M2 的原因可能是乙型肝炎病毒引起的自身免疫反应或病毒性乙型肝炎并发PBC。本研究中有45 例病毒性乙型肝炎同时M2 抗体阳性的病例，通过临床表现、实验室指标、病理诊断等综合判断其中有8 例最终诊断为病毒性乙型肝炎并发PBC。根据乙肝病人和PBC病人各自的临床、实验室指标特点本文从以下几个方面进行分析，希望对临床上M2 阳性乙肝病人是否合并PBC 的鉴别诊断提供可能的参考依据。

表4 三组间抗线粒体抗体阳性率及滴度[n(%)]分布

PBC 好发于中年女性，患病年龄高峰期为40 ～60 岁[11]，而乙型病毒性肝炎患者中男性比例高于女性[12]，本文中的PBC 组与单纯乙肝组性别构成与以上特点相符。本研究中M2 阳性的PBC 组的ANA，AMA 以高滴度(≥1∶320）为主，而乙肝组主要以低滴度（≤1∶100）为主，而乙肝并发PBC 组自身抗体谱模式与PBC 组相似。这一结果与以往孙丽梅等[13]的研究一致，这些结果表明低滴度的ANA，AMA，M2 抗体阳性诊断PBC 的意义不大，而乙型肝炎患者若检测高滴度的ANA，AMA，M2 抗体多为乙型肝炎并发PBC，若检测到低滴度的ANA，AMA，M2 抗体则单纯性乙型肝炎可能性较大，自身抗体谱的阳性可能为乙型肝炎病毒引起的自身免疫性反应。由于本研究属回顾性横断面研究，未对低滴度M2 抗体阳性的乙型肝炎患者进行纵向研究，因此不清楚这些所谓的单纯性乙型肝炎患者自身抗体谱是否会随着病情进展而改变，或是否会进展为并发PBC，有待后续进一步研究。此外，M2 抗体为AMA 抗体中一个亚型，M2阳性而AMA 抗体阴性有可能因为M2 抗体检测使用的免疫印迹法灵敏度、特异度与AMA 抗体检测的间接免疫荧光法存在差别造成两种检测方法的阳性率不符。相关报道表明联合M2 抗体和AMA抗体检测可提高诊断PBC 的准确度[14]，本文中乙肝组AMA-M2 与AMA 同时阳性的概率为21.62%（8/37），要远低于PBC 组的93.02%(120/127)及乙肝并发PBC 组的100%（8/8）。

由于病毒性乙型肝炎和原发性胆汁性胆管炎的病理基础不同，前者以肝细胞破坏为主，后者是以肝内胆小管进行性破坏为主要病变的非化脓性胆管炎，进而导致胆汁淤积，因此虽然两种疾病患者的酶学、胆红素代谢和脂代谢等生化指标均有不同程度的改变却各有特点，正如本研究所显示的，乙型肝炎患者的肝细胞炎症指标ALT 和AST 升高显著高于PBC 患者，PBC 患者则以反映胆汁淤积或胆管炎症等指标（如GGT，ALP 等）升高较乙型肝炎患者明显，而乙型肝炎并发PBC 患者，这些指标的改变兼有二者的特点。上述结果与周晓冬等[15]报道相符。由于胆红素可影响脂代谢，相关报道表明PBC 病人常并发以TC, TG, LDL 升高为主的血脂异常[16]，本文中乙肝组TG, TC, HLD, LDL 水平均低于PBC 组，但乙肝组与乙肝并发PBC 组间血脂水平无显著差异，这给病毒性乙型肝炎是否并发PBC 鉴别诊断造成一定的困难。此外，IgM 升高是PBC 实验室特征之一，此研究中乙肝组IgM 水平显著低于PBC 组和乙肝并发PBC 组，与李青梅等[17]报道一致。

综上所述，M2 抗体并非仅出现于PBC 患者中，也可出现于病毒性乙型肝炎等非PBC 患者中。因此临床上病毒性乙肝患者出现M2 抗体阳性需注意鉴别诊断是否并发PBC：首先，单纯M2 阳性乙肝病人抗核抗体、AMA 抗体多以低滴度为主，且M2抗体多为弱阳性，而乙型肝炎并发PBC 者的抗核抗体、AMA 抗体多为高滴度阳性；其次，单纯M2阳性乙肝病人ALT 升高较为明显，若血清GGT,ALP, IgM 水平升高较为明显且血脂异常者则并发PBC 的可能比较大。