宫颈癌患者Kruppel样因子6，p21蛋白表达水平与病理特征及化疗敏感性的相关性分析

徐晓锋，王 纯，卢国丰，孟亚萍，周勤芬，胡明珠，石 琴

（上海健康医学院附属嘉定区中心医院a.妇产科；b.病理科，上海 201800）

近年来，宫颈癌的治疗取得明显突破，但宫颈癌患者的复发率、死亡率仍然居高不下。手术后同步化疗是宫颈癌患者首选的治疗方案，但由于个体的化疗敏感性差异，部分患者未能从化疗中获益，治疗难度大[1]。寻找一种科学、可行的途径筛选化疗敏感患者增强化疗疗效，改善预后一直是宫颈癌治疗领域的研究热点[2-3]。Kruppel 样因子6（KLF6），p21 蛋白均为抑癌基因，研究认为其与细胞增殖、分化及血管生成等调控过程密切相关，同时参与多种恶性肿瘤的发生、发展，但国内关于二者表达水平与宫颈癌患者化疗敏感性的关系及作用机制研究仍鲜有报道，具有较大研究价值[4-5]。本研究拟采用免疫组化染色法检测宫颈癌患者KLF6，p21 蛋白的表达，探讨其对化疗敏感性的评估价值。

1 材料与方法

1.1 研究对象 回顾性分析2016年1月～2018年12月我院妇科收治的40 例宫颈癌患者。入组标准：①均经影像学检查及组织病理确诊，且临床资料完整；②临床分期为II～Ⅳ期，均接受同步化疗，预计存活期超过3 个月；③排除化疗药物过敏、并发化疗禁忌症、精神障碍、严重心肝肾功能障碍者。年龄42～74（56.22±5.19）岁；病理类型：鳞癌14例，腺癌26 例；低分化者13 例，中分化者19 例，高分化者8 例。

1.2 仪器与试剂 鼠抗人KLF6 多克隆抗体、鼠抗人p21 单克隆抗体（美国Santa Cruz 公司）。

1.3 方法

1.3.1 化疗方法：所有患者均接受TC 化疗方案：卡铂（山东齐鲁药业，批准文号：国药准字H10920028）按照曲线下面积（AUC）=5 计算剂量后静脉滴注，d1；紫杉醇（意大利百时美施贵宝公司，批准文号：国药准字H20020582）175 mg/m2静脉滴注，d1；3 周为1 个疗程，共3 个疗程。

1.3.2 观察指标

1.3.2.1 KLF6，p21 蛋白表达：测定所有宫颈癌组织标本均以甲醛固定，石蜡包埋、切片、烤片、脱蜡、染色。采用免疫组化Enivison 二步法检测，KLF6，p21 蛋白分别采用鼠抗人KLF6 多克隆抗体、鼠抗人p21 单克隆抗体，工作浓度分别为1:300，1:100。阳性对照采用已知标准片，阴性对照采用磷酸盐缓冲液（PBS）代替一抗。

1.3.2.2 免疫组化结果判定：将染色强度分为4 个等级，其中无染色为0 分，浅黄色为1 分，黄褐色为2 分，棕褐色为3 分；高倍光镜下观察染色的阳性细胞范围，百分比≤5%为0 分，6%～25%为1 分，26%～50%为2 分，≥51%为3 分。根据染色强度、阳性细胞比例二者得分乘积计算阳性强度：0～1 分为阴性（-），2～3 分为弱阳性（+），4～6 分为中阳性（++），＞6 分为强阳性（+++）。

1.3.3 化疗敏感性评估：以化疗效果为基础，参照1.1 版实体瘤疗效评价标准[6]评估化疗敏感性。完全缓解(CR)：原发肿瘤病灶完全消失；部分缓解(PR)：原发肿瘤病灶最大径及其最大垂直径的乘积下降超过50%，且维持4 周以上；病变稳定（SD）：原发肿瘤病灶两径乘积下降25%～50%，未见新发病灶，且维持4周以上；病变进展（PD）：原发肿瘤病灶两径乘积增加超过25%，或可见新发病灶。其中，CR，PR 纳入化疗敏感组[即客观缓解率（ORR）=(CR+PR)/ 总病例数×100%]，SD，PD纳入化疗抵抗组。

1.3.4 随访：化疗后通过电话、门诊复查或入户等形式进行随访，了解患者病情进展情况及死亡的具体死因。总生存期(OS)是指从初次治疗至死亡或随访截止之间的时间，随访截止时间为2020年3月。

1.4 统计学分析 采用SPSS 18.0 版统计软件包，计数资料以阳性率（%）表示，比较采用χ2检验；采用Kaplan-Meier 生存分析法分析KLF6，p21 蛋白表达与OS 的相关性。P＜0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 宫颈癌患者KLF6，p21 蛋白阳性表达与临床病理特征的相关性 见表1。宫颈癌中KLF6，p21 蛋白阳性率与病理分期、肿瘤直径、分化类型及化疗敏感性相关，差异均有统计学意义（均P＜0.05），而与年龄无显著相关性（P＞0.05）。

2.2 KLF6，p21 联合检测与宫颈癌化疗敏感性关系KLF6+/p21- 者ORR(CR+PR) 为85.71%(18/21)，SD+PD 为14.29(3/21)，显著高于非KLF6+/p21-者42.11%(8/19)，SD+PD 为57.89%(11/19),差异有统计学意义（χ2=8.33，P＜0.05）。

2.3 宫颈癌KLF6，p21 蛋白阳性表达与OS 的相关性 见图1，图2。Kaplan-Meier 法显示，宫颈癌患者的中位OS 为11.20 个月（95%CI: 9.73～12.71），其中KLF6 阳性者中位OS 为11.90 个月（95%CI:10.81～12.99），KLF6 阴性表达者中位OS 为9.20个月（95%CI: 9.05～9.35）。p21 蛋白阳性者中位OS为9.14 个月（95%CI: 8.26～10.22），p21 蛋白阴性表达者中位OS 为11.62 个月（95%CI: 9.63～13.58）。经log-rank 检验，KLF6 阳性者的中位OS 显著高于阴性表达者，而p21 蛋白阳性者的中位OS 显著低于阴性表达者，差异均有统计学意义（χ2=11.50，6.23，均P＜0.05）。

表1 宫颈癌患者KLF6，p21 蛋白阳性表达与临床病理特征的相关性

图1 宫颈癌患者KLF6 蛋白表达水平与OS 的关系

图2 宫颈癌患者p21 蛋白表达水平与OS 的关系

3 讨论

近年来，宫颈癌的发病率不断升高，且发病年龄也趋于年轻化，其原因尚不完全清楚，研究认为可能与基因的缺失或异常表达有关[7]。TC 方案是宫颈癌患者常用的化疗方式，主要通过结合细胞DNA 形成稳定加和物导致DNA 损伤，阻断肿瘤细胞恶性增殖。NCCN 指南推荐将以顺铂为基础的每周化疗方案用于复发或转移性宫颈癌一线治疗，可将此类患者5年无复发生存率提高20%[8]。但由于个体差异性，部分患者对化疗药物的敏感性较低，经足量化疗后肿瘤消退仍不令人满意，且往往预后不佳。

KLF6 基因是普遍表达的锌指转录因子9，研究显示其对心肺等组织器官生长发育、血管生成具有诱导作用，还可通过蛋白酶依赖途径、Rb 通路以及与多种基因启动子结合的方式调节细胞凋亡、增殖及分化等过程[9]。ZHANG 等[10]研究表明，KLF6 基因在肾细胞癌、肺癌等多种恶性肿瘤中的突变和向下调节作用，与浸润深度、分化程度及同步放化疗敏感性有关。p21 蛋白作为一种细胞周期依赖激酶（CDK）抑制物，通过CDK 抑制细胞分裂，阻断细胞周期从G 期向S 期的过渡，从而抑制细胞生长。研究发现，p21 可调节细胞周期与DNA 复制、修复之间的关系，与恶性肿瘤缓解率、治疗效果有关，并可作为判断预后的重要指标[11]。本研究结果显示，宫颈癌中KLF6，p21 蛋白阳性率与病理分期、肿瘤直径、分化类型及化疗敏感性相关（P＜0.05），KLF6 高表达、p21 蛋白低表达者化疗敏感性更高，与WANG 等[12]研究结果相符。有研究认为，p21是KLF6 的直接靶基因，KLF6 通过非p53 依赖通路上调p21，促进CDK 对细胞周期的阻滞作用，从而抑制细胞增殖[13-14]。

进一步分析发现，KLF6+/p21-者ORR 为85.71%，显著高于非KLF6+/p21-者的42.11%（P＜0.05），表明KLF6 高表达且p21 蛋白低表达者化疗敏感性最高，二者联合检测可作为宫颈癌患者化疗敏感性的预测指标。生存分析显示，宫颈癌患者的中位OS 为11.20 个月（95%CI: 9.73～12.71），其中KLF6 阳性表达、p21 蛋白阴性表达者中位OS 显著高于KLF6阴性表达、p21蛋白阳性表达者（P＜0.05），表明KLF6，p21 蛋白表达水平均可作为宫颈癌的独立预后因素，与车亚等[15]研究结果基本一致。由此可见，检测KLF6，p21 表达有助于筛查完全宫颈癌化疗敏感患者，同时可用于化疗的近远期疗效预测，从而优化治疗方案，进一步提高治疗效果。

综上所述，宫颈癌患者KLF6，p21 蛋白表达水平与其临床病理特征相关，KLF6 高表达、p21蛋白低表达者化疗敏感性高，且预后更好，可作为预后、个体化治疗方案选择的评价指标。