甲状腺疾病患者血清Tg-CIC中Tg-Ab水平检测及相关临床研究

陶昭君,成 军，戴玉柱

(中国人民解放军联勤保障部队第九〇三医院a.医学工程科；b.检验科，杭州 310013)

甲状腺球蛋白(thyroglobulin, Tg)是一种隐蔽性自身抗原，在正常人血清中的含量较低(1～50μg/L)[1]，一般情况下不会刺激机体产生抗甲状腺球蛋白抗体(Tg-Ab)。因Tg 的半衰期为4～6 天，所以短时间内Tg 升高不会刺激机体，而长时间则会刺激机体产生Tg-Ab，此时异常升高的Tg 与刺激机体产生的Tg-Ab 相结合形成甲状腺球蛋白免疫复合物(Tg-CIC)[2]。

自从1974年KONISHI[3]首次报道在桥本甲状腺炎患者血清中发现甲状腺球蛋白免疫复合物(Tg-CIC)后，Tg-CIC 在甲状腺疾病中的病理机制和血清Tg-CIC 检测，一直是临床内分泌学、流行病学专家关注的焦点[4-5], Tg-CIC 的检测主要有放射免疫分析法(RIA)[6]、酶免法(EIA)[7-8]两大类。RIA 优点甚多如：重复性好、测量的方法简单、灵敏度高并且成本低等。不足的地方是比较难以实现测量和操作的自动化。EIA 是目前实验室和临床常规工作中最常用的方法，双特异性抗体ELISA 法灵敏度低，特异性、重复性差等，在检测自身免疫性甲状腺疾病患者时实际阳性检出率并不高，C1q 法是非特异方法，阳性结果无法判断是否是Tg-CIC 形成的。迄今为止还没有一种针对甲状腺疾病患者血清Tg-Ab 阳性时，可以灵敏、特异地定量检测血清中的Tg-CIC。

但由于甲状腺患者多伴有血清Tg-Ab 阳性及Tg-CIC 检测方法学的局限性[9]，Tg-CIC 在甲状腺疾病患者中的阳性分布、血清Tg-CIC 含量与疾病进展的相关性研究报道甚少[10]，使Tg-CIC 在甲状腺患者的病理机制、临床意义及流行病学特征等方面，一直未得到深入、系统的研究。因此，我们采用自主研制的免疫复合物解离技术对甲状腺患者血清Tg-CIC 进行分离、解离，通过检测Tg-CIC 解离后的Tg-Ab 含量来确定甲状腺患者血清中Tg-CIC水平，并结合甲状腺疾病患者相关的临床资料进行比较分析，从而阐明Tg-CIC 在甲状腺疾病中的临床以及流行病学意义。

1 材料与方法

1.1 研究对象 收集自 2017年11月～2018年1月，来我院门诊就诊甲状腺疾病患者血清标本187例，其中甲状腺功能亢进46 例，甲状腺功能减退35 例，甲状腺肿瘤40 例，甲状腺结节33 例，甲状腺炎33 例；男性74 例，女性113 例，年龄49±11.7 岁；患者的血清标本根据实验需要进行离心分离后分装，-70℃冻存备用，并且避免反复冻融。

1.2 仪器与试剂 四硼酸钠(Na2B4O7·10H2O)分析纯( 重庆市科龙化工有限公司)，三( 羟甲基)氨基甲烷生化试剂(生工生物)，聚乙二醇6000(PEG600)(上海合成洗涤剂二厂)，氯化钠(NaCl)分析纯(成都市科龙化工试剂厂)，浓盐酸(HCl)(兰溪市六洞山试剂厂)，硼酸(H3BO3)分析纯(重庆市科龙化工试剂厂)，甘氨酸(C2H5NO2)分析纯(国药集团化学试剂公司)、抗甲状腺球蛋白抗体测定试剂盒(雅培贸易有限公司)。I 2 000 免疫分析仪(美国雅培)，SHA-EA 低温水浴恒温振荡器(金坛市精达仪器制造有限公司)恒温范围：5～100℃ ，振荡频率：0～300r/min。试剂配制：依据自主专利配制免疫复合物解离技术对所用的相关试剂进行配制[11-13]。

1.3 方法

1.3.1 分离：向2 支1.5ml Ependoff 管分别加入150μl 血清标本和150μl 免疫复合物(Circulating immune complex, CIC)分离剂，混匀后置4℃至少6h 或过夜，12 000×g 离心5min 弃上清；向含沉淀物管中加入150μl 复溶剂和150μl CIC 分离剂，混匀后置4℃至少6h 或过夜，1 2000×g 离心5min弃上清，并沥干。

1.3.2 复溶：向含有沥干的CIC 沉淀物Ependoff管中分别加入10μl CIC 复溶剂，振荡至溶液中无块状沉淀物。

1.3.3 空白样品检测：将一支Ependoff 管标记为空白管，加入70μl 缓冲液解离剂和70μl 缓冲液解离中和剂，混匀后检测Tg-Ab 含量作为空白值。

1.3.4 CIC 解离：将另一支Ependoff 管标记为测定管，加入70μl 缓冲液解离剂，于15℃放置30min，加入70μl 缓冲液解离中和剂，混匀后检测Tg-Ab 含量作为测定值；

1.3.5 结果判断：空白值＞Cutoff，测定值＞Cutoff，且测定值＜110%空白值，即血清标本中不存在CIC；反之则存在CIC，含量=测定值-空白值。

1.4 统计学分析 数据的处理采用SPSS22.0软件，计数资料用率(%)表示，采用χ2检验进行统计。计量资料为正态分布采用均数±标准差（±s）表示，为非正态分布时采用M (Q1 ～ Q3)表示，非正态分布多组定量样本数据间比较采用Kruskal-Wallis H 检验，两组数据相关性评价采用线性回归分析，P＜0.05 为差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 甲状腺疾病患者血清中Tg-CIC 阳性率调查187 例患者血清标本中有174 例检出Tg-CIC，Tg-CIC 总阳性率高达93.05%。阳性患者中甲状腺功能亢进患者44 例(95.65%,44/46)，甲状腺功能减退患者31 例(88.57%,31/35)，甲状腺肿瘤患者38 例(95.0%,38/40)，甲状腺结节患者32 例(96.97%,32/33)，甲状腺炎患者29 例(87.88%,29/33)，其中甲状腺结节阳性率最高，高达96.97%，甲状腺炎患者阳性率最低，为87.88%，各组间的差异无统计学意义(χ2=3.950, P ＞0.05)。

2.2 各甲状腺疾病患者血清游离及其CIC 中Tg-Ab 含量情况 见表1，图1。在各种甲状腺疾病患者血清中游离Tg-Ab 含量差异无统计学意义(H=3.882，P＞0.05)。另检测各种甲状腺疾病患者血清CIC中Tg-Ab 含量，差异无统计学意义(H=5.58，P＞0.05)。

2.3 各组甲状腺疾病患者血清中游离Tg-Ab 含量与CIC 中Tg-Ab 含量的相关性分析 见图2。对各组甲状腺疾病患者血清游离Tg-Ab 与Tg-CIC 中Tg-Ab 含量进行相关性分析，甲状腺功能亢进、甲状腺炎以及甲状腺结节患者血清中游离Tg-Ab 含量与CIC 中Tg-Ab 含量的相关性r²值分别为0.22,0.29, 0.157，为正相关(P＜0.05)。甲状腺功能减退、甲状腺肿瘤血清中游离Tg-Ab 含量与CIC 中Tg-Ab 含量的相关性r²值分别为0.009 和0.004，均P＞0.05，无相关性。

图1 各组甲状腺患者CIC 中Tg-Ab 含量测定结果

图2 各组甲状腺疾病患者血清游离Tg-Ab 与CIC 中Tg-Ab 含量相关性分析图

3 讨论

人体最重要的内分泌腺之一就是甲状腺，甲状腺主要有分泌功能，可以分泌甲状腺球蛋白(Tg)，Tg 在正常范围内(1～50μg/L)不会刺激机体产生抗甲状腺球蛋白抗体(Tg-Ab)，但当甲状腺分泌Tg超过50μg/L 或当Tg 释放过多时，便会刺激机体产生Tg-Ab。此时Tg 与Tg-Ab 则发生抗原抗体反应，在体内形成Tg-CIC。有文献报道Tg-CIC 测定在临床上对评估甲状腺疾病的发生、发展具有重要的意义[14]，因此本文对各种甲状腺疾病患者血清游离Tg-Ab 和Tg-CIC 中Tg-Ab 进行检测，经过统计分析发现，Tg-CIC 在各组甲状腺疾病中均可出现，并且阳性率较高。另外结果显示疾病组间的阳性率差异无统计学意义(χ2=2.917, P＞0.05)，说明在不同的甲状腺疾病中都存着Tg-CIC，而且和甲状腺疾病的种类无关。

对不同甲状腺疾病患者血清游离Tg-Ab 和Tg-CIC 中的Tg-Ab 含量进行检测并比较，结果显示：不同甲状腺疾病患者间血清中游离Tg-Ab 含量差异无统计学意义(H=3.882, P＞0.05)，不同甲状腺疾病患者间血清CIC 中Tg-Ab 含量差异无统计学意义(H=5.5842, P＞0.05)。说明在不同的甲状腺疾病间，其血清中的游离Tg-Ab 含量以及CIC 中Tg-Ab 含量与疾病的类型无关，且分布呈现偏态，因此，在发生甲状腺疾病时虽然产生了相应的抗体，但这些抗体及其免疫复合物的含量与疾病的种类无关，我们推测其产生的量不仅和血清Tg 含量有关，还和个体免疫应答能力密切相关。

对不同甲状腺疾病患者血清中游离Tg-Ab 与其CIC 中的Tg-Ab 含量进行相关性评价发现：甲状腺功能亢进、甲状腺炎以及甲状腺结节患者血清游离Tg-Ab 与其CIC 中的Tg-Ab 含量呈现正相关，从侧面说明了Tg-CIC 含量的高低和机体产生Tg-Ab 的含量存在关联性，间接的说明了Tg-CIC的产生和机体免疫应答能力的关联性。而甲状腺功能减退、甲状腺肿瘤患者血清游离Tg-Ab 与其CIC中的Tg-Ab 含量无相关性，其中肿瘤患者可能其甲状腺已经被肿瘤细胞完全破坏[16]，血清中的Tg 释放不连续，导致产生Tg-Ab 量不稳定，从而出现了Tg-Ab 与其CIC 中的Tg-Ab 含量呈现无相关的现象。

综上所述，甲状腺疾病患者血清中大多数可检出Tg-CIC 与疾病的类型无关，不同的甲状腺疾病间，其血清中的游离Tg-Ab 含量以及CIC 中Tg-Ab含量与疾病的类型无关。甲状腺功能亢进、甲状腺炎以及甲状腺结节患者血清游离Tg-Ab 与其CIC 中的Tg-Ab 含量呈现正相关，而甲状腺功能减退、甲状腺肿瘤患者血清游离Tg-Ab 与其CIC 中的Tg-Ab含量无相关性，为我们进一步了解Tg-CIC 与甲状腺疾病的发生、发展的相关性研究奠定了基础，提供了新的研究视角。