蓝舌病病毒非结构蛋白研究进展

赵瑶，易华山,3，马鲜平，李前勇,3，谢远兵

（1.西南大学动物科学学院，荣昌 402460；2.重庆市兽医科学工程研究中心，荣昌 402460；3.西南大学医学研究院免疫学研究中心，荣昌 402460；4.重庆市永川区动物疫病预防控制中心，重庆 402160）

蓝舌病（Bluetongue,BT）是蓝舌病病毒（Bluetongue virus, BTV）引起的，以库蠓为传播媒介的一种反刍动物非接触性虫媒传染病，其易感动物为绵羊、山羊、牛和鹿等反刍动物，是OIE划定为A类、我国列为一类的重要动物疫病。蓝舌病于1876年最早发现于南非，随后美国、澳大利亚、中国、南美、南欧和地中海、北欧等国家和地区陆续暴发该病，已成为名副其实的世界性流行虫媒传染病[1,2]。目前，BTV已发现至少有27种不同的血清型[3]，不同血清型之间交叉反应很低或无交叉免疫保护反应。研究还发现，有两个假定的新型 BTV血清型（BTV-28[4]和BTV-29[5]）。BTV主要经媒介昆虫库蠓叮咬，雌蠓交配后嗜吸牛、羊血而传播，因此BT的发生具有地域性（主要大概率存在于南纬40°与北纬53°之间的广大区域）、季节性（5～10月间）和周期性等特点[6]。BTV感染动物具有高感染率和死亡率的特征，绵羊死亡率最高可达75%。目前，BT分布于除南极洲外的全球大部分地区，且近年来逐渐呈现出向高纬度地区蔓延流行的趋势。

1 BTV蛋白概述

BTV隶属于呼肠孤病毒科(Reoviridae)环状病毒属(Orbivirus)的双股RNA病毒。BTV基因组全长为19 219bp，由L1、L2、L3、M4、M5、M6、S7、S8、S9和S10等10个大小不同的节段分别编码VP1、VP2、VP3、VP4、NS1、VP5、VP7、NS2、VP6/NS4、NS3/NS3a蛋白[7]；其中位于S9片段上的NS4蛋白是目前认为最小的非结构蛋白，由具有高度保守性的77～79个氨基酸残基组成[8]。BTV的病毒粒子呈圆形二十面体对称，成熟的病毒粒子无囊膜；BTV完整的病毒粒子由7种结构蛋白（VP2、VP5、VP3、VP7、VP1、VP4、VP6）及基因组dsRNA组成。结构蛋白VP1-VP7构成病毒粒子的外层衣壳和病毒核心颗粒（图1），其中外层衣壳由VP2及VP5两种蛋白构成；病毒核心颗粒由两种主要蛋白（VP3、VP7）、三种次要蛋白（VP1、VP4、VP6）及10条分节段的dsRNA构成，其中VP3、VP7构成病毒粒子的内层衣壳，除去外层衣壳和VP7蛋白层的中间结构构成BTV的亚核心颗粒（图1）[9]。

图1 BTV粒子结构蛋白和基因组分布示意图

2 主要结构蛋白

2.1 外层衣壳蛋白

VP2和VP5蛋白以三聚体的形式存在，是构成BTV外壳的主要结构蛋白，也是BTV型特异性抗原。VP2是由L2基因编码的型特异性蛋白，其蛋白上存在多个能够诱导机体产生对BTV中和反应的中和表位，是中和抗原和血清型的决定因子[11]。当外界环境因素变化及内部宿主免疫反应不同时，可导致新的BTV血清型出现[12]。VP2蛋白位于病毒表面，介导病毒与宿主最初接触，参与BTV的吸附及进入[13]。VP5蛋白由M6编码，是BTV唯一的糖基化蛋白，具有细胞穿透活性，直接参与膜的穿透过程[14]。当BTV暴露于早期内吞体（Early endosome，pH6.0-6.5）低pH环境下，VP5 N端匕首结构域发生构想变化，使其M1-S41基序及WHXL脂质作用W411-L414基序与内吞体膜发生膜融合作用，随着VP2蛋白的完全拆卸、降解，VP5蛋白的匕首（dagger domain）蛋白和伸展结构域（unfurling domains）可实现显著重折叠[15,16]。VP5蛋白锚定结构域中的β-折叠片（β-meander motif）基序含有组氨酸簇，可感知晚期内吞体pH（Late endosome，pH 5.5）以释放四个假定的膜相互作用蛋白而从晚期内吞体内释放，实现具有转录活性的病毒颗粒进入感染细胞质内[9]。

2.2 核心衣壳蛋白

病毒核心颗粒由VP3、VP7、 VP1、VP4、VP6及10条分节段的dsRNA构成。VP7蛋白由S7基因编码，以三聚体形式存在，在不同BTV血清型中具有高度保守性[17]，含有群特异性抗原决定簇，可用于建立BTV群特异性抗原抗体检测方法[18]。VP3蛋白由L3基因编码，以十聚体形式存在。BTV VP3蛋白包裹着3个具有酶催化活性的次要蛋白VP1、VP4和VP6及dsRNA片段，共同构成BTV的亚核心颗粒，在维持病毒结构的完整性方面发挥重要作用。VP1、VP4和VP6蛋白在BTV的病毒颗粒内部构成病毒三蛋白转录复合物（tri-protein transcriptase complex，TC）[9]。VP1蛋白由L1基因编码，具有RNA依赖的RNA聚合酶活性，能够在不依赖于其他蛋白的作用下以ssRNA为模板合成ds RNA。VP4蛋白是一种由M4基因编码的加帽酶，与其他许多病毒的加帽酶不同的是，BTV VP4具有在转录物的5'末端产生甲基化帽子结构所需的所有催化活性[19]。VP6蛋白由S9基因编码，具有ATP依赖的RNA解旋酶活性，对BTV的复制与转录具有重要作用，在RNA包装中必不可少[20]。VP6蛋白还具有ATP结合活性，与VP3具有特定的结合亲和力，能够促进病毒的复制及mRNA的合成[21]。

3 非结构蛋白

BTV侵染宿主细胞后，经过大量扩增，释放到血液中，经血液循环以感染宿主细胞[22]。BTV感染宿主细胞后，在感染的细胞内产生NS1、NS2、NS3/NS3a、NS4 5种非结构蛋白。BTV非结构蛋白虽不参与病毒粒子的组成，但在病毒的复制、成熟、释放过程中具有重要作用；并且可用作抗BTV的靶抗原用于鉴别诊断BTV野毒感染与疫苗免疫的动物[22]。

3.1 NS1蛋白

NS1蛋白由M5基因编码，长度为1 689bp，共编码552个氨基酸，其蛋白大小为64kDa。在BTV感染细胞的过程中，NS1蛋白表达量高，以聚合物形式在宿主细胞的细胞质中形成一种病毒特异性管状结构（tubular）和一种非管状结构（non-tubular），促进病毒mRNA的复制及其蛋白的合成[23]。由这种管状结构形成的蛋白具有高度保守性，目前仅在呼肠孤病毒科环状病毒属的病毒感染的细胞中发现。研究表明，BTV NS1与BTV单链RNA的3´端ACUUAC六核苷酸相互作用，保证病毒RNA的优先选择性表达[24]。反向遗传学（RG）研究表明，BTV的NS1、NS2帽状RNA对促进病毒 VP1、VP3、VP4、VP6蛋白的表达及对BTV病毒的拯救具有重要的调节作用。此外，当BTV感染宿主细胞后，NS1蛋白聚集于细胞中心体区域，在一定程度上会导致细胞中心体的破坏，从而影响细胞正常的有丝分裂[25]。Agüero等在2000年利用BTV-2型NS1基因建立的RTPCR方法检测感染动物的组织和血液样本中的BTV，该方法还可用来鉴别诊断BTV-2型野毒感染和商业疫苗免疫动物[26]。Rojas等为了评估BTV感染过程中T细胞免疫应答，利用BTV-8型NS1蛋白在C57BL/6小鼠中筛选了11个潜在的T细胞表位，在接种BTV-8的C57BL/6小鼠和绵羊中具有引起特定IFN-γ和细胞毒性T淋巴细胞（CTL）产生；并进一步用IFN-γ ELISPOT分析绵羊BTV-8感染，证明这些T细胞表位的特征可用来开发更加广谱的BTV血清型疫苗，并实现BTV感染动物与疫苗免疫动物的鉴别诊断[27]。

3.2 NS2蛋白

NS2是一种由S8基因编码的多功能蛋白质，编码357个氨基酸，分子量为42kDa。NS2是BTV感染细胞期间合成的唯一的以磷酸化形式存在的病毒蛋白，参与受感染细胞中形成BTV病毒纤维网络状包涵体（Viral inclusion bodies，VIBs）；在BTV复制的早期阶段，NS2促进了三种酶蛋白和VP3形成起初的复制酶复合物[28]。研究表明，在杆状病毒表达系统及昆虫细胞中表达的NS2蛋白具有结合核糖核酸的特性，并通过结合ATP和GTP，可将两个核苷水解成相应的NMPs，NS2对ATP的结合亲和力远高于GTP，对ATP水解效率更高；Ca2+、Mg2+和Mn2+可以作为所需的二价阳离子参与水解反应[29]。在BTV感染细胞后，NS2破坏细胞内微管与染色体的相互作用，导致染色体有丝分裂中纺锤体不能正确地与微管对接，诱导细胞进行异常有丝分裂[25]。研究表明，在BTV感染细胞中NS2主要位于细胞核附近，经细胞激酶磷酸化后，具有很强的单链RNA结合活性，在细胞质内招募BTV基因组mRNA；NS2蛋白对新产生的亚核蛋白（VP1、VP4、VP6和VP3）和10个节段的RNA转录物直接募集到VIBs中，并在VIBs中与VP3组装成亚核心颗粒，然后再获得VP7蛋白生成稳定的病毒核心粒子，但非磷酸化状态的NS2则会干扰VIBs的形成而影响病毒粒子的形成[30]。Roy[31]等研究表明，BTV NS2是病毒复制和组装的调节剂，也是VIB的一个重要组成成分，干扰NS2蛋白则影响VIB的形成而导致病毒释放量减少。

3.3 NS3/NS3a蛋白

NS3、NS3a蛋白均由BTV基因组中S10基因编码，是NS3基因产物的两种形式。NS3a是NS3全长序列的N端截短蛋白，长度分别为26kDa、24kDa，两种蛋白的氨基酸序列在不同的环状病毒属之间存在较大的差异[32]。NS3/NS3a在哺乳动物细胞中具有细胞毒性，在昆虫细胞中毒性更强，也能抑制哺乳动物细胞中病毒诱导的干扰素免疫应答[33]。研究表明，NS3/NS3a蛋白是BTV编码蛋白中唯一具有两个跨膜结构域的膜糖蛋白，参与BTV感染细胞中释放子代病毒颗粒的过程。非洲马瘟（AHSV）与BTV结构相似，其非结构蛋白NS3/NS3a同样参与细胞膜的改变及其病毒粒子释放，推测BTV NS3/NS3a也通过改变细胞膜功能来促进病毒粒子的释放[34]。NS3/NS3a在BTV蛋白中具有序列一致性和高度保守性，其在昆虫细胞中高度表达，但在哺乳动物细胞中表达量较少或者不表达[35]。与BTV同属的茨城病病毒（IBAV）可诱导多种哺乳动物细胞系的凋亡，而在昆虫中不能诱导细胞凋亡，这种病毒引起的细胞凋亡可能与NS3/NS3a表达有关，推测BTV也可能有类似的调节机制[36]。NS3还可与NS1形成融合蛋白，经纯化后的NS1-NS3融合蛋白可用于间接ELISA检测BTV抗体[37]。近期有研究发现，NS3在通过ERK1/2的磷酸化水平和翻译起始因子eIF4E作用下能够激活MAPK/ERK通路，从而促进病毒基因组的复制[38]。

3.4 NS4蛋白

Mourad Belhouchet等在S9片段中发现的一个重叠ORF编码的非结构蛋白NS4，长77～79个氨基酸，是最小的非结构蛋白[8]。通过在线软件预测发现NS4蛋白存在2个α-螺旋区，无跨膜区，具有亮氨酸拉链（bZIP）典型结构；存在典型的核定位信号及具有线粒体亚细胞定位特征。吕爽等[39]对NS4二级结构预测，其N端α-螺旋结构域中具有富含碱性氨基酸的核定位信号（NLS），而C端α-螺旋结构域中具有亮氨酸拉链结构的核输出信号(NES)。研究表明，在BTV侵染细胞过程中，NS4蛋白具有核-胞浆穿梭过程[39]。BTV NS4在使用I型干扰素处理的细胞中具有复制的优势，表明NS4是一种干扰素拮抗剂。与其他病毒的非结构蛋白一样，BTV NS4蛋白可能与JAK1/TYK2相结合，抑制感染细胞中IFN-α/β的产生而逃避宿主天然免疫应答，从而实现拮抗干扰素介导的天然免疫，逃脱宿主天然免疫应答[40]。

4 展望

BTV编码的7种结构蛋白在BTV基因的转录与复制、病毒的吸附、感染宿主细胞的过程中是必需的，4种非结构蛋白也参与BTV的复制、组装及释放，其中NS1蛋白促进病毒RNA的翻译及调节病毒蛋白的合成；NS2蛋白是病毒包涵体的主要组成成分；NS3/NS3a参与BTV感染细胞中释放子代病毒颗粒的过程；NS4参与拮抗干扰素介导的天然免疫应答。BTV作为一种重要的dsRNA媒介病毒和病毒研究的模型系统已被广泛研究，对BTV非结构蛋白及其在病毒基因组复制及其蛋白组装机制的深入研究，为开发新的诊断试剂、蛋白质和衣壳疫苗以及符合DIVA标准的新型减毒病毒BTV疫苗提供了基础。