大肠杆菌对奶牛子宫内膜上皮细胞NF-κB信号通路的影响

姜烨琪，张瑞真，王雅丽，崔璐莹，王亨，李俊，李建基

(1.扬州大学兽医学院，扬州 225009；2.江苏省动物重要疫病与人兽共患病防控协同创新中心，扬州 225009)

子宫内膜炎的直接病因是病原微生物的感染。细菌是引起子宫内膜炎的最重要病原微生物。目前，大肠杆菌是从子宫内膜炎患牛子宫分离出的重要细菌之一[1]。核转录因子-kB（NF-κB）信号通路在炎症反应和先天免疫中具有重要作用。为了探索大肠杆菌对子宫内膜细胞的致病作用是否与激活此信号通路有关这一问题，本研究设计了体外试验，采用106CFU/mL大肠杆菌处理原代培养的奶牛子宫内膜上皮细胞，并检测其NF-κB信号通路的磷酸化情况，以研究大肠杆菌对奶牛子宫内膜上皮细胞NF-κB信号通路的影响。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 奶牛子宫组织

自扬州某屠宰场，无菌采集未孕的健康奶牛子宫组织。

1.1.2 主要试剂与仪器

试剂：DMEM/F12培养基、106CFU/mL大肠杆菌；无内毒素胎牛血清（四季青生物科技公司）；蛋白酶抑制剂、RIPA裂解液（北京普利莱基因技术有限公司）；BCA法蛋白浓度测试试剂盒（上海碧云天生物技术有限公司）；兔抗鼠Phospho-NF-κB p65，Phospho-IκB-α、β-actin一抗（CTS，美国）；山羊抗兔二抗（CST，美国）。仪器：PVDF膜（Millipore，美国）；紫外分光光度计（Thermo公司，美国）；蛋白电泳系统（BIO-BAD公司，美国）等。

1.2 方法

1.2.1 原代细胞培养与细胞传代

将无菌采集的奶牛子宫组织送回实验室。在超净工作台内将子宫角剪成3～4cm的小段，用提前预冷的含有5%双抗的PBS反复冲洗3次，直到洗出澄清液体，于4℃静置30min，然后将子宫角纵向剖开，修剪为约3×3cm2的小块，放入含0.1%链蛋白酶的DMEM/F12基础培养基中，完全浸没子宫角组织，于4℃消化16～20h。取出子宫角，用灭菌手术刀轻轻刮取子宫角内膜，放置于PBS中重悬，1 200r/min离心5min，弃去上清液，再加PBS重悬，离心，重复3次。然后加入含15% 胎牛血清的DMEM/F12完全培养基，吹打成细胞悬液，于37℃、5%CO2饱和湿度的细胞培养箱中培养，每天更换一次细胞培养液，3～4d可获得原代细胞。采用胰蛋白酶消化法进行上皮细胞传代培养，在37℃、5%CO2饱和湿度下培养，每天更换一次细胞培养液，约3d即可获得传代培养细胞[2]。

1.2.2 Western blot 法检测NF-κB信号通路关键蛋白的表达量

将细胞按106cells/孔浓度接种到六孔细胞板内，待80%以上细胞汇合后用PBS清洗，更换含大肠杆菌（106CFU/mL）的基础培养基分别处理0、15、30、45、60、90min，收集细胞。将细胞加入适量的细胞裂解液提取总蛋白。每组统一上样5μg/孔，将蛋白样本进行SDS-PAGE凝胶电泳1.5h。然后将所需蛋白转移至PVDF膜上，用5%脱脂乳封闭1h。使用1∶1 000稀释的β-actin一抗孵育PVDF膜，4℃过夜。清洗后，将PVDF移到含有兔抗鼠HRP偶联IgG二抗的封闭液中（1∶10 000 稀释），室温孵育1h。使用DAB显色试剂盒显影，并用化学发光成像系统采集图像，根据得到的图像数据对试验结果进行分析。

1.2.3 数据处理

试验数据采用SPSS 18.0软件中的One-way ANOVA和Duncan法进行统计分析，结果以均值±标准误表示。P〈0.05表示差异显著，P〈0.01表示差异极显著。

2 结果与分析

奶牛子宫内膜上皮细胞经大肠杆菌（106CFU/mL）的基础培养基处理不同时间（0、15、30、45、60、90min），用Western blot法检测P65、IκB-α和p-P65、p-IκB-α蛋白的表达水平。结果如图1所示。与空白对照组相比，在经大肠杆菌（106CFU/mL）的基础培养基处理30min时，p-P65蛋白表达量显著升高，其他时间点的p-P65蛋白表达量没有显著变化。在经大肠杆菌（106CFU/mL）的基础培养基处理15min和30min时，p-IκB-α蛋白表达量显著升高，其他时间点的p-IκB-α蛋白表达量没有显著变化。

图1 大肠杆菌处理不同时间点对奶牛子宫内膜上皮细胞p65和I κB-α蛋白表达的影响

3 讨论

大肠杆菌是奶牛肠道内正常菌群成员之一，在幼畜出生后数小时即可经口进入消化道后段并在消化道大量繁殖而定居，终生伴随。该菌在奶牛肠道内，大多数条件下是不致病的共栖菌，在特定条件下移位入侵肠外组织或器官可致病[3]。在正常情况下，哺乳动物子宫是一种无菌环境，但在交配或分娩期间通常容易被大肠杆菌等病原菌感染[4,5]。病原菌侵入子宫后，黏附并侵入子宫内膜组织中，子宫内膜上皮细胞和基质细胞通过先天免疫受体（如TLRs）感知病原体和损伤相关分子（PAMPs），诱导炎症介质的大量分泌，并促进中性粒细胞和巨噬细胞的浸润[6,7]。奶牛子宫在交配、分娩和产后恢复期间易受细菌感染[8～10]，而感染细菌后，25%～30%奶牛的子宫会出现持续的炎症反应，并最终导致不孕[11,12]。

研究发现，NF-κB作为一种广泛存在的转录因子，在奶牛子宫受细菌感染后能参与转录各种与炎症和免疫反应有关的基因[13]。所以，本研究将奶牛子宫内膜上皮细胞经大肠杆菌（106CFU/mL）处理不同时间（0、15、30、45、60、90min），模拟奶牛子宫内膜受到大肠杆菌侵染的过程，研究大肠杆菌对奶牛子宫内膜上皮细胞NF-κB信号通路的影响，以探究大肠杆菌对奶牛子宫内膜炎的致病机理[14]。

本试验通过Western blot法检测P65、IκB-α和p-P65、p-IκB-α蛋白的表达水平，结果提示大肠杆菌（106CFU/mL）培养一定时间可显著提高p-P65蛋白和p-IκB-α蛋白表达量，促进NF-κB信号通路的激活。研究证实，大肠杆菌通过激活NF-κB信号通路引起奶牛子宫内膜炎症损伤，因此，抑制NF-κB信号传导通路可能成为治疗大肠杆菌引起的奶牛子宫内膜炎的有效途径[15～17]。