A2纯合基因型荷斯坦牛选育技术研究

蒋桂娥，赵利梅，杨晨东，瞿长伟，马亚宾，李春芳，刘廷玉，周希梅，倪俊卿

（1.河北省畜牧良种工作总站，石家庄 050061；2.纽勤生物科技（上海）有限公司，上海 200000；3.全国畜牧总站，北京 100125）

众所周知，牛乳中的乳蛋白主要分为酪蛋白、白蛋白、乳球蛋白和乳铁蛋白等，含有20多种氨基酸。其中酪蛋白是乳蛋白的主要存在形式，占总量的80%，可以说是一种全价蛋白。牛奶中的β-酪蛋白以A1和A2两种基因型存在。A1基因型β-酪蛋白在消化过程中会产生β-酪啡肽（BCM-7），而这种肽与人胃肠道不适反应有关。有报道指出，中国居民乳糖不耐受主要原因可能是人体对牛奶中A1基因型β-酪蛋白的不耐受[1]，从而出现一些消化道的不适，比如腹痛、腹胀、恶心、腹泻和便秘。有研究认为，饮用A1基因型牛奶会提高心脏病、动脉粥样硬化等心血管疾病[2]和Ⅰ型糖尿病的风险[3]，原因也是A1基因型牛奶在消化过程中会产生β-酪啡肽（BCM-7），且被人体吸收，而A2基因型β-酪蛋白不会产生BCM-7[4]。所以，饮用A2基因型牛奶可以降低冠心病的发病率，减少胃肠道炎症反应[5]。也有报道称，饮用A2基因型牛奶可以提高机体免疫力，且对儿童的认知、大脑发育或大有裨益。

随着A2牛奶进入高端消费市场，对A2型牛奶和牛群的研究日渐增多。本研究通过全群基因组分型，一是筛选A2纯合基因型荷斯坦牛，组建A2纯合基因型荷斯坦牛育种群；二是通过育种技术与含有A2纯合基因型公牛开展有计划选配，自主定向培育A2纯合基因型奶牛。以此培育A2纯合基因型奶牛群，生产更好的优质牛奶，丰富市场，满足不同消费群体需求，改善居民体质，为河北省创造更加优质牛奶奠定基础。

1 试验材料

1.1 试验动物

试验动物来自旗帜乳业有限公司（察北）和乐源牧业威县有限公司（一牧）两个大型奶牛场的健康牛群，其三代系谱完整，随机抽取健康泌乳牛只11 785头。

1.2 试验试剂

毛发DNA试剂盒（NAP44912），购自德国sbeadex TM公司。

1.3 试验仪器

NanoDrop 8000（型号：NANODROP 8000），磁珠法自动核酸提取仪（型号：MagMax-KingFisher FLEX），Multifuge X3R-冷冻离心机，均购自ThermoFisher科技公司；涡旋振荡器（型号：Vertex Genie 2），购自 Scientifuc Industries厂家； Dispense repeater M4-分液器，购自德国Eppendorf股份公司。

2 试验方法

2.1 毛发样品的采集

首先使用刷子清理待检奶牛尾根部的牛毛，去除粪便和污物，使用止血钳或手拔出一簇牛毛（约80～100根），挑选20～50根毛发根部带有白色完整毛囊的牛毛，并在牛毛采集卡上记录牛号和采样日期，打开牛毛收集卡中间层上的透明不干胶带，将带有毛囊的牛毛小心放在中间层上，用透明不干胶密封压紧，并剪去长于牛毛采集卡的毛发，存放于塑料自封袋内。

2.2 基因型分型检测

样品采集完成后委托纽勤生物科技（上海）有限公司进行检测。应用MassARRAY质谱技术检测出SNP位点，通过PCR扩增目标序列，然后加入SNP序列特意延展引物，在SNP位点上延伸一个碱基。将制备的样本分析物与芯片基质共结晶后在质谱的真空管经强激光激发，此时核酸分子分解吸附为单电荷离子，电场中离子飞行时间与离子质量成反比。通过检测核酸分子在真空管中的飞行时间获得样品分析物的精确分子量，从而检测出SNP位点信息。

3 结果与分析

3.1 样本基因型分型结果

表1 荷斯坦牛基因分型结果

表1结果显示，在随机抽取的试验样本中，A1纯合基因型奶牛1 890头，占16.13%； A2纯合基因型奶牛4 219头，占36.01%；A1A2杂合基因型奶牛5 607头，占47.86%。结果表明，本次试验中A1A2杂合型奶牛占比最高，A2纯合基因型次之，占检测样本的三分之一以上，A2型等位基因频率为59.94%。

3.2 A2A2纯合基因型牛群选育技术研究

目前国外的一些乳企已经开始生产和销售A2型牛奶，国内君乐宝乳业有限公司、三元乳业公司也开始生产和销售A2品牌的乳制品。其奶源均来自β-酪蛋白A2型牛群。因此，应用MassARRAY质谱检测技术快速、精准地对奶牛基因组分型，是目前筛选A2纯合型基因奶牛个体行之有效的方法之一。针对筛选出的A2纯合型奶牛个体，与A2纯合基因型的公牛计划选配，可自主培育A2纯合基因型荷斯坦牛育种核心群；对A1A2杂合基因型奶牛个体组建单独核心群，利用与A2纯合基因型的公牛计划选配，使A2型基因不断纯合，可达到扩增A2纯合基因型育种核心群的目的。同时，结合DHI测定、线性鉴定技术，可定向培育出高产、A2基因型β-酪蛋白遗传基础的种公牛，为河北省乳制品品质优化奠定种质基础。

4 讨论

关于A2纯合基因型奶牛在牛群中所占比例的报道不一致。在国内A2纯合型所占比例也存在差距，山东奥克斯畜牧种业有限公司检测23头种公牛，A2纯合基因型公牛占56.52%，A2型等位基因频率为72.7%[6]；武泽文等研究结果表明，宁夏地区荷斯坦牛A2纯合基因型占38.49%，A2型等位基因频率为62.70%[7]。本次研究结果表明，在随机抽取的11 785份样本中A2纯合基因型奶牛占36.01%，A2型等位基因频率为59.94%，低于宁夏和山东的研究结果。但与国外的研究结果基本吻合，即在新西兰、英国和意大利中部一些牧场A2等位基因频率的奶牛占牛群比例分别为55%[8]、58%[9]和60.65%[4]，而意大利中部地区荷斯坦福瑞斯品系A2纯合基因型奶牛占36.96%[4]。这可能与筛选的牛群品种、品系、牛群结构和检测样本基数有直接关系，也可能与样本类型和检测流程有关。也有不少学者的鉴定结果显示，不同品种牛的A2基因频率存在显著差异，如：水牛A2等位基因的频率为100%，瘤牛为98.7%，更赛牛为96%～98%，瑞士褐牛为66%～70%，娟珊牛为50%～63%，荷斯坦牛为44%～53%，爱尔夏牛为40%～49%，丹麦红牛为23%[10]。

5 小结

就A2基因型牛奶的特性而言，通过现代分子生物技术，找出可用于分子标记辅助选择的关键基因SNPs位点，开展验证性检测和统计分析，从而更好地开展A1和A2基因型母牛分型，并利用选育技术，组建A2纯合基因型奶牛核心群，不仅对相关实验的研究意义深远，还对促进奶业生产转型升级，优化乳品品质结构，提高养殖经济效益和社会效益作用重大。