间充质干细胞对人冻融卵巢组织移植后低氧期保护作用的研究进展

程姣姣 阮祥燕 杜 娟 谷牧青

(首都医科大学附属北京妇产医院内分泌科，北京 100026)

世界卫生组织(World Health Organization，WHO)[1]数据显示，中国2018年新发癌症患者达428.5万例。随着肿瘤治疗学的进步，癌症患者的生存率有了极大提高。与此同时，年轻癌症患者在临床痊愈后对生育要求也越来越迫切，78.3%～90.0%的年轻癌症患者有生育及再生育的强烈需求[2]。放射治疗(以下简称放疗)和细胞毒类抗癌药物的应用在挽救癌症患者生命的同时，难以避免地造成卵巢功能不可逆的损伤[3]。接受10～15 Gy照射剂量的青春期前女孩未来发生早发性卵巢功能不全(premature ovarian insufficiency, POI)的风险为30%～70%，高剂量烷化剂的应用使化学药物治疗(以下简称化疗)后闭经的发生率高达40%～80%[4-5]，骨髓移植患者POI发生率可高达70%～100%，故生育力保护非常重要。

对于需要接受性腺毒性疗法的女性，可以选择多种生育力保存方法，即胚胎冻存、卵母细胞冻存和卵巢组织冻存，卵巢组织冻存是近年全球防治医源性POI的一种重要的生育力保护方法[6-7]，可在一片组织中保存成百上千个卵细胞，不依赖于患者的生理周期，无须超促排卵，不会延误癌症的最佳治疗时间，不仅能够有效保存患者生育力，还能在一定程度上恢复卵巢的内分泌功能[8]，是青春期前女孩和需要立即抗癌治疗患者的唯一选择[9]。全球已有超过145个活产婴儿通过此技术诞生[10]，在过去10年中婴儿出生数呈指数级增长，研究[11]显示高达95%的患者移植后卵巢功能恢复，但仅63%的卵巢组织移植后能存活1年，由于卵巢组织移植没有血管吻合，因此移植物经历了缺氧和局部缺血的过程，持续3～5 d才能观察到进行性血管重建，从第7天开始可以看到功能性血管[12]，从第10天开始可以进行有氧代谢重建，卵巢组织在移植后的早期有很多卵泡丢失[13]，因此移植需要进一步优化。本文主要从应用间充质干细胞优化冻融卵巢组织移植，改善冻存卵巢组织移植早期低氧期卵泡丢失等的研究进展进行综述。

1 卵巢组织冻存移植后早期低氧期损伤

卵巢组织冻存是一项工作密集型的技术，包括卵巢取材手术、组织的处理、冷冻和长期保存，移植物必然是一种非常有限的资源，而且对于患者来说，往往是一种最后的选择，因此减少卵泡丢失，从而在移植物中保留尽可能多的原始卵泡很重要。对新鲜和冻融卵巢组织比较的研究[14]显示，卵泡存活率和功能相似。卵巢组织冻存移植过程丢失的卵泡中，据估计至少有75%是在移植过程中丢失，因为移植物在新的环境中重新血管化并恢复内稳态，因此移植后的优化工作可能会对最终的卵泡储备产生很大的影响。

1.1 卵巢移植后早期卵泡的丢失

窦状卵泡在卵巢处理过程中会被机械地去除，较小的生长卵泡因极易受到冷冻和复苏的影响可能会在冻存复苏过程中丢失。移植后卵泡丢失的机制主要是缺血和激活，移植物中卵泡的存活依赖于缺血、缺氧初期新生血管组织，移植物在低氧环境中营养物质和氧气由周围组织通过扩散提供，时间约为3～5 d[11]，在血运重建能够为移植物提供充分的氧气和营养前，时间可能需要长达7～10 d[15]。在血管生成期，移植物受到缺血再灌注损伤，导致炎性反应介质、自由基和活性氧的产生[16]，缺血再灌注损伤主要通过影响生长卵泡的颗粒细胞导致卵泡丢失，而原始卵泡由于处于休眠状态，细胞代谢率较低，比较不容易受到缺血损伤的影响，在血管化较差的卵巢外侧皮质中，它们习惯于相对低氧的环境[17]。原始卵泡在移植物中过度募集可能是由于组织处理、冻融以及移植后缺血导致生长卵泡的广泛丢失所致，生长中的卵泡通过分泌抑制因子，主要是抗苗勒管激素(anti-Müllerian hormone, AMH)在抑制原始卵泡激活方面起着重要作用[18]。移植后立即发生的原始卵泡大量丢失同时伴随着早期生长卵泡数量的显著增加和过渡性和早期生长卵泡颗粒细胞增生的增加[14, 19]。在卵巢组织移植患者中，早期也观察到AMH显著升高，随后恢复到低水平，有时检测不到[20]。

Hippo信号和蛋白激酶B(protein kinase B，PKB)信号是原始卵泡激活的主要调节信号[21]，有研究[22]通过卵巢碎片化或药物治疗，包括第10号染色体上磷酸酶和张力蛋白同源缺失基因(phosphate and tension homology deleted on chromsome ten,PTEN)抑制剂和磷脂酰肌醇3-激酶(phosphatidylinositol 3-kinase,PI3K)激活剂通过破坏Hippo信号来促进体外原始卵泡的激活，从而促进卵泡的生长，以便能够用于体外受精(in vitro fertilization, IVF)，这也就是体外激活(in vitro activation, IVA)。卵泡激活的多少直接影响移植物的原始卵泡的储备，移植物中原始卵泡的诱导激活在短期内增加了生长卵泡的数量，但导致移植物寿命缩短，这可能适用于立即获取成熟卵泡体外受精，但牺牲了移植物的整体生育潜力和长期的内分泌功能。对51例POI患者进行了IVA，总共有5例(10%)妊娠和3例(6%)活产。一般来说，POI患者自然妊娠率为5%～10%，因此IVA的成功率可能低于完全不干预的效果[23]。卵巢组织冻存移植目前主要用于癌症患者，一旦病情临床痊愈后，会将卵巢组织自体移植，移植目的是尽可能长时间地恢复卵巢功能，通过激活失去大量原始卵泡会适得其反[24]。相比之下，IVA目前目标是针对卵巢储备极低，对控制性卵巢刺激反应差的女性，加速激活的目的是在移植后立即刺激少数剩余的卵泡生长[25]。

1.2 卵巢组织移植后的功能

目前卵巢组织移植后95%的患者能恢复卵巢功能，但移植物存活时间各不相同[26]，某些情况下单次移植物可维持功能数年，连续妊娠多达4次，而其他移植物可能在几个月内停止功能，决定移植物寿命的是移植后移植物中存活下来的原始卵泡的最终数量，分析卵泡丢失的原因对于最大限度延长移植物寿命和优化卵巢组织冻存移植技术是必要的[27]。

卵巢移植物中成熟血管的快速形成对于限制缺血性损伤和移植后高比例卵泡储备的耗竭非常重要。考虑到移植后存活的卵泡数量减少，但卵巢移植物确实可以存活数年，从而可用于重复怀孕和活产。在人类生殖过程中，卵泡激活和丧失的速率是非线性的，受卵巢内外信号的调节，控制着招募、生长、选择和闭锁速率之间的复杂相互作用[28]。卵巢内对卵泡募集的调节包括PI3K-PTEN通路、KIT配体、AMH、神经生长因子(nerve growth factor, NGF)和骨形态发生蛋白(bone morphogenetic protein, BMP)蛋白家族成员等。此外，研究[29]显示卵巢的结构和原始卵泡的密度起着自我调节的作用，因此休眠卵泡池的减少会降低招募的速度。卵巢外因素的影响在研究[30]中也得到了证实，接受单侧卵巢切除术的患者，其绝经年龄仅比正常绝经年龄早1～2年，在卵巢储备降低的情况下，身体调整卵泡重新募集率以保存卵泡的这种能力，也可能在卵巢移植中发挥作用。在移植急性期后，卵巢内外的调节因子都可能通过调节招募速率来识别和响应移植物的有限储备，以减少卵泡激活和丢失，并最大限度地延长移植物的寿命。

2 间充质干细胞的研究应用

间充质干细胞(mesenchymal stem cells, MSCs)可以分离自骨髓、外周血、牙髓和脐带，MSCs具有分化为几种细胞谱系的能力，例如脂肪细胞、成骨细胞和神经元样细胞，众所周知，MSCs在组织再生、血管生成和伤口修复上具有很大的能力[31]，不论来源如何，MSCs都通过分泌各种生物活性分子和细胞因子来支持细胞增生和存活[32]。MSCs的再生和抗凋亡作用是由于它们大量的生物活性分子，包括角化细胞生长因子，碱性成纤维细胞生长因子(basic fibroblast growth factor, FGF)，血管内皮细胞生长因子(vascular endothelial growth factor, VEGF)，白血病抑制因子(leukemia inhibitory factor, LIF)，BMP-4，胰岛素样生长因子-1(insulin-like growth factor 1, IGF-1)和表皮生长因子(epidermal growth factor, EGF)等，它们是重要的卵泡生成调节剂[33]。根据MSCs与共培养细胞之间的交互作用，利用MSCs作为饲养细胞提供了长期且适当的旁分泌营养因子来源。

脐带间充质干细胞(umbilical cord-derived mesenchymal stem cells, UCMSCs)是一种有前途的干细胞来源，用于基于细胞的治疗[34]。在多种疾病模型中，如糖尿病[35]、类风湿关节炎[36]等，UCMSCs已显示出通过免疫调节促进组织修复，并且UCMSCs已在临床上用于治疗新生儿缺氧缺血性脑病(hypoxic-ischemic encephalopathy of newborn, HIE)[37]。

脂肪来源干细胞(adipose tissue-derived stem cells, ASCs)最早由Zuk等[38]描述，从人脂肪抽吸物中分离出并构成具有多种谱系分化能力的MSCs。由于采用微创手术易于收获脂肪以及细胞密度高，它们在再生医学中的应用正在普及。实际上，目前正在进行或已经完成了许多评估ASCs安全性和有效性的临床试验(Ⅰ～Ⅱ和Ⅲ期)[39]，对研究[40-41]，已证实了它们具有多系分化潜能、通过分泌生长因子并分化为功能性血管来促进血管生成的能力。ASCs的自分泌/旁分泌因子称为分泌体(secretome)，参与受损组织的再生过程，诱导血管生成，减少细胞凋亡、细胞死亡，调节免疫系统，分泌体可能是一种新的细胞疗法，治疗效果与注射活细胞相当，甚至优于注射活细胞，称为无细胞疗法(cell-free therapy)[42]。

3 间充质干细胞在卵巢组织移植中应用的研究

在过去的十年中，卵巢组织移植的主要挑战之一是延长移植组织的寿命和质量，以便为希望怀孕的癌症幸存者提供改善妊娠结局的机会。异种移植模型研究[43]采用生长因子(growth factor, GF)如VEGF，抗氧化剂如N-乙酰半胱氨酸[44]、促红细胞生成素[45]、维生素E、褪黑激素和类固醇激素等方法，但迄今为止，尚未见到可向临床转化的显著改善，还有在食蟹猴自体卵巢移植模型中研究了在移植之前准备血管床[46]。有研究[47-48]采用各种来源的MSCs，利用其促血管生成、抗凋亡和免疫调节特性，2018年Manavella等[49]描述了一种利用ASCs促进异种移植人卵巢组织血运重建的方法，在卵巢组织移植前两周采用高浓度ASCs来提前准备移植部位，可以提高移植物内部的氧合和血运重建率，并提高卵泡存活率和减少细胞凋亡。Manavella等[49]观察到移植后7 d卵泡平均存活率为62%，与添加ASCs相关的早期血管化和氧合增加可以解释卵泡丢失的减少。采用ASCs的移植程序是朝着潜在解决卵巢组织移植后大量卵泡丢失问题迈出的有希望的一步。总之，证明了在移植后早期卵巢组织的含氧和血管形成率更高，这与增加的卵泡存活率和减少的细胞凋亡相关。未来的研究应集中于阐明卵巢组织移植中MSCs的作用机制，以期于临床应用[50]。

临床前实验[51]表明，缺氧处理的ASCs在创面愈合、心肌细胞再生和软骨修复等方面具有较好的效果，表明其在缺血性疾病和软骨缺损的治疗方面具有巨大的应用潜力，低氧处理的MSCs可能会减少卵巢组织移植早期的卵泡丢失。研究[52]显示，缺氧对包括ASCs在内的MSCs的有益作用主要归因于低氧诱导因子-1a(hypoxia-inducible factor -1a, HIF-1a)，缺氧上调HIF-1a，进而增强MSCs的活性、 增生、可溶性因子的分泌、软骨形成潜能、迁移和植入潜能。在常氧条件下，HIF-1α被抑癌基因产物泛素化，翻译后被胞质中的蛋白酶体降解，抑制HIF-1α介导的基因转录。但缺氧条件下，HIF-1α与血管紧张素转运蛋白的结合受到抑制，导致HIF-1α稳定并移位到细胞核内。HIF-1α与HIF-1β发生二聚反应，形成HIF-1复合物，该复合体将与靶基因启动子中称为缺氧反应元件(hypoxia-responsive elements, HREs)的DNA序列结合。关于低氧条件培养间充质干细胞后与卵巢组织共移植是否可促进卵泡的存活和减少凋亡尚未见报道。

4 小结与展望

卵巢组织冻存移植作为一种生育力保护方法，被越来越多地用于性腺毒性治疗的年轻女性，世界各地也出现越来越多的怀孕和活产。卵巢组织移植的目标是尽可能长时间地恢复卵巢功能，以实现多次排卵和妊娠，并恢复内分泌功能。因此优化的重点在于减少移植物中的卵泡损失，以此作为延长移植物寿命和生育力的基础。减少缺血损伤和/或减少卵泡激活的药理学方法可以潜在地减少移植后的卵泡丢失，目前研究[50-52]表明间充质干细胞可促进移植物的血管形成，减少卵泡的损耗，从而提高移植物的存活时间，为患者提供更大的长期获益，但仍需进一步验证和研究其作用机制，以及研究低氧预处理间充质干细胞是否更加优化卵巢组织移植。