缺血/缺氧预适应的神经保护作用研究进展

吴 剑 谷亚坤 刘 佳*

(1. 首都体育学院运动科学与健康学院， 北京 100191； 2. 首都医科大学北京脑重大疾病研究院， 北京 100069)

短暂的亚致死性的伤害可以诱导对随后的致命伤害产生强有力的保护。20世纪末，Murry等[1]证明了多次短暂的缺血发作可以保护心肌免受随后持续性缺血损伤，这种现象被称为“缺血预适应”。当然，缺氧并不等于缺血，但两者往往会导致相同的病理改变，同时可能具有共同的机制。缺血/缺氧预适应对心血管、免疫和呼吸系统疾病的保护作用已被证明[2-4]。近年来研究[5]证实，缺血/缺氧预适应同样可以抵抗脑损伤，如缺血性卒中、新生儿缺氧/缺血、以及神经退行性疾病等。除原位缺血/缺氧预适应外，通过反复短暂性肢体缺血也可以减轻远隔器官的缺血损伤，这种“远隔缺血预适应”现象最近在临床试验中得到了广泛的研究[6]，似乎更具临床应用价值，因为其避免了对心脏和脑等重要脏器直接进行缺血缺氧的刺激。笔者将重点介绍缺血/缺氧预适应的脑保护机制，其在神经系统疾病中的研究进展，以及将这些临床前模型转换到临床环境中的挑战。

1 缺血/缺氧预适应的脑保护机制

缺血/缺氧预适应可以通过不同的分子机制发挥脑保护作用。笔者将从低氧细胞信号通路激活、降低能量代谢、抗氧化应激、抗炎性反应等几个方面讨论缺血/缺氧预处理的神经保护机制。

1.1 激活低氧信号通路

氧感应系统主要以缺氧诱导因子(hypoxia inducible factors, HIFs)的调节为核心。HIF家族目前已知有3个成员，HIF-1、HIF-2、HIF-3。HIF-1普遍存在于人和哺乳动物细胞内，是蛋白质合成的关键调节因子，由氧敏感性α亚基和结构稳定性β亚基构成。在生理条件下，HIF-1α亚基被脯氨酸羟化酶(prolyl hydroxylase domain, PHDs)羟基化，从而促进了其与抑癌基因希佩尔-林道(von Hippol-Lindau, VHL)的结合，导致HIF-1α的泛素化和降解。而在低氧条件下，HIF-1α与HIF-1β结合形成复合物，移位到细胞核，随后与靶基因上的缺氧反应元件结合，诱导包括多个基因的转录激活[7]。

研究[8]表明缺氧预适应可以增加新生和成年动物大脑中的HIF-1。HIF-1被激活后会介导多种下游蛋白的转录调控，包括血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor, VEGF)、促红细胞生成素(erythropoietin, EPO)、葡萄糖转运蛋白-1(glucose transporter type 1,GLUT1)等，从而响应缺氧。VEGF是低氧时由肾、睾丸、肺、肝、心、脑等器官产生的重要信号蛋白。在大脑中，VEGF可存在于神经元、星形胶质细胞和小胶质细胞中，可参与调控新生血管的再生，增加缺血部位的毛细血管密度和通透性，减轻缺氧缺血引起的神经损伤[9]。动物模型研究[10]表明，低氧预适应可促进VEGF的表达增加。GLUT1是一类调控细胞外葡萄糖进入细胞内的跨膜蛋白，在脑、血脑屏障、心肌等组织中高表达，负责维持血糖稳定及供能[11]。研究[12]显示，缺血、缺氧条件下，活化的HIF-1使GLUT-1mRNA及蛋白的基因表达上调，葡萄糖摄取增加，有助于增加神经组织对缺血、缺氧的耐受性。EPO是一种影响红细胞生成的重要体液因子，对缺血、缺氧敏感，主要通过与红细胞膜上特异性EPO受体结合发挥促红细胞增生分化的作用，对神经系统的保护作用涉及抗凋亡、抗炎、抗氧化、营养神经、促神经祖细胞增生分化等多种机制[13]。HIF-1激活的下游基因的蛋白产物在血管生成、血管反应性和重塑、葡萄糖和能量代谢、细胞增生和存活、红细胞生成和铁稳态等方面发挥着关键作用[7]。因此，上述低氧信号通路的关键元件已成为疾病治疗研究的重要靶点，在低氧诱导的组织损伤治疗方面显示出巨大价值。

1.2 降低能量代谢

对冬眠和其他耐缺氧状态下的特定适应性神经保护策略的研究[14]显示，低氧耐受的机制部分是通过抑制代谢和改变离子通道活性来抑制细胞功能而维持细胞稳态来实现的。研究[15]显示，与缺血损伤后大量免疫防御策略相关基因的上调相反，缺氧预适应会造成许多基因的转录反应被抑制，这些基因参与控制新陈代谢、细胞周期调节和离子通道活动。缺氧预处理同样造成蛋白质加工相关基因受到抑制，从而使能量需求降低[16]。缺氧预适应可通过抑制某种特定酶而降低脂肪酸代谢，从而减少对ATP的需求。而这一作用在神经系统可直接影响星形胶质细胞，有研究[17]报道星形胶质细胞在葡萄糖、酮体、氨基酸等底物中优先利用脂肪酸代谢产生乳酸，这为邻近优先使用乳酸进行氧化磷酸化供能的神经元的新陈代谢提供底物。在适应冬眠和缺血期间有限的氧气供应中，抑制细胞功能作为一种平衡供与需的有效手段。

1.3 抗氧化应激

正常情况下，机体具有有效的内源性抗氧化防御体系，而任何因素导致过量自由基不能被及时清除，将会引起一系列DNA损伤、酶失活、脂质过氧化等损伤[18]。氧化应激是体内氧化与抗氧化失衡的一种状态。机体在代谢过程中产生过多活性氧(reactive oxygen species, ROS)或清除活性氧的能力下降，是导致衰老或心脏病、癌症、糖尿病以及神经退行性疾病等多种疾病的一个重要因素。缺血/缺氧预适应可通过多种信号通路、多种因子相互作用的抗氧化应激途径降低脑损伤[19]。

线粒体呼吸链是细胞活性氧的主要来源，线粒体中ROS的产生是脑和心脏缺血耐受的主要触发因素之一。线粒体是真核生物中负责许多关键细胞过程的动态细胞器，其主要功能是通过三羧酸循环和氧化磷酸化供能，调节细胞内钙(Ca2+)和氧化还原信号，以及调节膜电位并控制细胞程序性死亡。事实上，线粒体在神经损伤中发挥多种保护作用，包括提高神经元活性、减少细胞内Ca2+内流、抑制ROS的产生、抑制细胞凋亡和维持ATP水平。线粒体呼吸链和线粒体ROS、解偶联蛋白-2和锰超氧化物歧化酶都是参与预处理诱导的神经保护反应的靶标和介质[20]。已知氧化应激可引起细胞外钙离子内流，而细胞可通过内质网、线粒体、高尔基体摄取钙离子以维持胞质内游离钙离子浓度稳定[21]。这与缺血/缺氧预处理可通过降低内质网应激和保存高尔基体功能来减少致死性缺血后神经元的死亡的研究结果相一致[22]。近年来，发现了许多具有强抗氧化活性的生物活性分子，包括热休克蛋白、褪黑素、银杏内酯、吡咯喹啉醌等[23]。因此，以氧化应激为靶点的新型药物的研究目前已成为神经系统疾病治疗领域的一大热点。

1.4 抗炎作用

神经系统损伤后引起炎性反应，包括促炎因子，如白细胞介素、肿瘤坏死因子(tumor necrosis factor-α，TNF-α)、核因子κB(nuclear factor kappa-B，NF-κB)等释放，星形胶质细胞、小胶质细胞等免疫细胞激活、增生、聚集[24]。机体早期通过炎性反应可清除病原菌，重建稳态，但过度炎性反应则会导致组织损伤。低氧预适应可减轻血-脑脊液屏障的破坏和缺血半球的炎性反应，有助于减轻随后的中风损害程度和梗死体积[25]。

有研究[26]报道，阿尔茨海默症模型小鼠经缺氧预适应的骨髓间充质干细胞移植，可降低信号转导和转录激活因子3和NF-kB的活化，上调抗炎因子IL-4和IL-10的表达，下调促炎细胞因子TNF-a和IL-1b的表达，降低星形胶质细胞和小胶质细胞的活化，增加小鼠脑内miR-21水平。研究[27]表明低氧预适应可促进星形胶质细胞成熟，增加谷氨酸转运体和谷氨酰胺合成酶表达，有助于随后的缺血缺氧脑损伤的保护。活化的星形胶质细胞还可以通过多种途径发挥神经保护作用，例如分泌多种神经营养因子、清除兴奋毒性物质、调控凋亡信号等。小胶质细胞是中枢神经系统内固有的免疫效应细胞，介导内源性免疫反应，发挥神经保护或毒性作用[28]。在中枢神经系统炎性反应过程中，小胶质细胞具有分化为M1或M2表型的能力，研究[29]显示M1型主要分泌促炎细胞因子而加剧细胞毒性。M2型主要通过其吞噬功能促进损伤修复，因此目前普遍认为M2表型比M1表型更有利于保护神经元和阻断疾病进展[30]。研究[3]显示缺血再灌注损伤会造成M1型小胶质细胞的激活，从而诱导或加剧神经损伤，而缺血/缺氧预适应可通过诱导小胶质细胞M2激活显著减轻中枢神经系统缺血损伤。

1.5 抗凋亡作用

凋亡是由基因控制的细胞自主有序的主动死亡过程，不同凋亡信号引发不同凋亡信号转导通路，最后汇集于下游的效应蛋白含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶(cysteinyl aspartate specific proteinase, caspase)，进入连续的反应过程。Caspase平时以无活性的酶原形式存在，激活途径主要有：受体激活途径，死亡信号(如TNF-α等)通过与细胞表面受体结合激活；线粒体激活途径，死亡信号作用下，线粒体膜受损，释放细胞色素c进入胞质与凋亡激活因子、ATP、Caspase 9等形成复合物，最后激活Caspase 3，引发级联反应[31]。缺血再灌注后TNF-α、细胞色素c含量及Caspase 3活性均升高。缺血预适应或缺血后适应实验[32]证实其可降低凋亡相关基因的表达及Caspase 3活性，证明了这种干预方式具有抗凋亡作用。

1.6 降低兴奋性毒性

兴奋性毒性是指由于神经元去极化，造成谷氨酸等兴奋性神经递质释放引起的病理过程。兴奋性毒性与多种神经系统疾病密切相关[33]。缺血受损的神经细胞释放兴奋性神经递质谷氨酸，可以刺激突触前谷氨酸受体如NMDA受体和AMPA受体，促进更多谷氨酸的释放。当突触间隙周围的谷氨酸浓度过高，神经元被兴奋性毒性杀死[34]。中枢神经系统谷氨酸稳态主要受兴奋性氨基酸转运体摄取活性的调节，其主要分布在星形胶质细胞，又被称为胶质谷氨酸转运体蛋白-1[35]。研究[36]证实，脑缺血预处理可通过上调胶质细胞谷氨酸转运体-1活性降低谷氨酸兴奋性毒性，从而诱导脑缺血耐受。

1.7 激活自噬

自噬是一种细胞自我保护的方式，自噬过程是通过双层膜包裹待降解物形成自噬体，运送到溶酶体形成自噬溶酶体并进行多种酶的消化和降解，控制着许多重要生理功能，对生存、分化、发育和动态平衡至关重要。根据细胞物质递送到溶酶体的途径不同，分为巨自噬、微自噬、分子伴侣介导的自噬。巨型自噬是目前研究最多的形式，研究[37]显示它有助于维持细胞成分的降解、合成和循环之间的平衡，并且与细胞死亡途径相关。自噬代表了一种适应性策略，在面对饥饿、感染和各种应激时，可以通过清除受损的蛋白质和线粒体，快速提供燃料供应能量，以及支持凋亡过程来维持细胞的动态平衡，从而延缓细胞死亡。在神经系统体外细胞模型中，低氧预适应增加了自噬小体的生成和降解[38]。体外缺血模型实验[39]也显示，亚致死性缺氧可刺激再灌注过程中的自噬，使细胞结构或自噬小体对随后的致命性损伤具有抵抗力。

2 缺血/缺氧预适应在神经系统疾病中的研究进展

神经系统疾病是一类多种原因波及脑血管及神经组织等的急/慢性、进行性加重的疾病，发病率高、危险性大。中枢神经系统疾病主要包括脑血管疾病、神经系统变性病、中枢感染性、免疫性、外伤性以及肿瘤性疾病等。其中最常见的是脑血管疾病，包括卒中、脑出血、蛛网膜下腔出血等;其次是一些神经退行性疾病，包括帕金森病(Parkinson’s disease, PD)、阿尔茨海默病(Alzheimer’s disease, AD)、亨廷顿病(Huntington disease，HD)、肌萎缩侧索硬化症(amyotrophic lateral sclerosis，ALS)等。神经系统疾病的发病机制复杂，涉及兴奋性毒性、细胞凋亡、氧化应激、免疫炎性反应等众多方面。缺血/缺氧预处理作为一种有潜力的治疗策略，已经在多种临床前研究中被证实具有神经保护作用[5]。以下将简介缺血/缺氧预处理在神经系统相关疾病中的应用研究进展。

2.1 脑血管病

缺血性脑卒中是由脑血管闭塞引起的，占脑卒中病例的80%。溶栓组织型纤溶酶原激活剂治疗急性缺血性卒中疗效较好，但治疗窗口较窄，所以寻找到早期预防的有效干预方法尤为重要[40]。在局灶性和全局性脑缺血的动物模型研究[41]表明区域特异性预处理刺激的诱导用于随后的神经保护。短暂性脑缺血发作(transient ischemic attack, TIA)可以被认为是一种原位的缺血/缺氧预适应，研究[42-43]显示卒中前有TIA病史的患者，初始弥散性病变往往较小，最终梗死体积也明显减小，同样揭示了缺氧/缺血预适应的保护作用。出血性卒中约占卒中的20%，治疗选择非常有限。缺血预处理可以减少蛛网膜下腔出血后的血管痉挛和迟发性脑缺血[44]。研究[45]报道了脑动脉瘤手术中的缺血预适应。在复杂的脑血管手术中，暂时阻断近端动脉可能是一种简单的脑保护操作。Sales等[46]也发现术前远隔缺血预处理降低了接受脑肿瘤手术切除的患者术后缺血性损伤的发生率。

2.2 神经退行性疾病

神经退行性疾病是指神经元进行性功能障碍和选择性死亡而诱发的一类神经系统疾病。这类疾病通常发病隐匿，进展缓慢，进一步研究缺血/缺氧预适应对于预防改善神经退行性疾病的作用具有重要意义。神经退行性疾病和卒中在神经元死亡前有着共同的病理生理过程。在神经退行性脑中可观察到血管异常、神经血管解偶联和自由基损伤。越来越多的证据[5]表明，间歇性低氧训练可以改善脑血管功能，在实验性AD中，间歇性低氧几乎阻止了脑血管和脑外血管的内皮障碍、脑血管网的稀疏和大脑皮质神经元的丢失，减轻AD病理，进而改善AD动物的脑灌注和认知功能[47]。间歇性低氧不仅对血管有作用，还可以防止神经元退化、刺激神经发生和再生[48]。在帕金森病的细胞模型中，外源性Wnt 1通过激活Wnt/β-catenin信号通路来阻止6-羟基多巴胺介导的线粒体损伤[49]。而缺氧诱导因子-1α可通过Wnt/β-catenin信号调节细胞对适应性过程的反应[50]。

2.3 多发性硬化症

多发性硬化(multiple sclerosis，MS)是以中枢神经系统白质炎性脱髓鞘病变为主要特点的自身免疫病，是中青年人群中最常见的神经系统疾病。其病因和发病机制尚未完全明确，可能涉及自身免疫、病毒感染、遗传倾向、环境因素及个体易感等综合因素。特征性病理改变是中枢神经系统白质内多发性脱髓鞘斑块，多位于侧脑室周围，伴反应性胶质增生，也可有轴突损伤[51]。病变常累及脑室周围白质、视神经、脊髓、脑干和小脑[52]。实验性变态反应性脑脊髓炎(experimental allergy encephalomyelitis，EAE)，其免疫发病机制和病损与MS相似[53]。在受EAE影响的小鼠的脊髓中，慢性中度低氧处理通过诱导抗炎环境来部分保护EAE小鼠，与调节性T细胞(Tregs)和抗炎细胞因子IL-10浓度增加相关[54]。除对免疫系统发挥抗炎作用外，低氧预处理对血管的强大重塑性也得到了不断证实。研究[55]表明，低氧预适应可通过优化血-脑脊液屏障完整性来抑制实验性自身免疫性脑脊髓炎，包括减少血管细胞黏附分子-1和细胞间黏附分子-1的表达，维持内皮紧密连接蛋白-1和闭合蛋白的表达，以及上调血管基底膜中层粘连蛋白-111的表达等。

2.4 脊髓损伤

脊髓损伤是脊柱损伤最重要的合并症，可导致损伤节段以下肢体严重的功能障碍。损伤往往伴随着一系列病理变化，包括神经元坏死、轴突变性、炎性反应、脱髓鞘、胶质瘢痕形成等。针对脊髓损伤的治疗研究以往主要集中于早期救治、药物治疗、合并症治疗等方面，近年来应用低压氧及高压氧预处理的物理干预手段得到一些研究者的关注。研究[56]表明，间歇性低氧可以改变突触可塑性，增加运动神经元中生长因子与营养因子的表达，并改善脊髓损伤大鼠的前肢运动功能。干细胞移植是治疗缺血性卒中、脊髓损伤、神经退行性疾病等的一种很有前途的再生疗法。低氧预处理与干细胞治疗相结合具有广泛的临床应用价值。低氧预处理的骨髓间充质干细胞移植可以促进大鼠脑缺血后血管生成和神经再生[57]。神经干细胞和缺氧预处理的间充质干细胞进行的另一项联合移植试验[58]也显示，神经干细胞移植到脊髓损伤部位后存活率提高。

3 小结

目前，有关神经系统疾病的很多预处理应用正在探索中。首先，需要考虑人群亚群的治疗异质性，包括年龄、 性别、饮食习惯等，以及建立标准化的机制或最佳刺激。预处理刺激的最佳持续时间、频率和大小因疾病而异，不同的低氧程度、持续时间、发作周期等将会产生截然不同的效应。其次，缺血/缺氧预适应的主要限制之一是，缺乏衡量或判断预适应效果的指标。特别是在慢性神经退行性疾病的情况下，对慢性应激细胞施加轻微的压力可能会加剧疾病状态，而不是提供治疗。这不仅需要了解预处理刺激和疾病的机制，而且还需要了解疾病不同阶段的病变细胞/组织/器官对轻度应激的反应，并寻找特定的生理生物标记物，从而更好地监控疾病进展或治疗效果。另外，将缺血/缺氧预适应与传统的药物治疗、干细胞移植等结合，是一种具有重要意义和潜力的疗法，仍有待深入探索。