水产源产细菌素乳酸菌的分离、筛选及鉴定

高 欣 ， 刘 颖 ， 刘凡湘 ， 王 洋 ，2*， 王竞儒 ， 罗云龙 ， 白东清 ，2

（1.天津农学院水产学院，天津 300384；2.天津市水产生态及养殖重点实验室，天津 300384）

我国水产动物的养殖以高密度或超高密度为主，这种养殖模式下水产动物易患细菌性疾病（Sundberg 等，2016；Pulkkinen 等，2009）。 抗生素类药物是治疗细菌性疾病的有效方式，但易引起耐药性、药物残留、抑制免疫系统等问题（Liu，2017；Cabello，2006）。 我国自 2020 年 1 月1日起，退出除中药外的所有促生长类药物饲料添加剂品种（申桂英，2019）。微生态制剂具有拮抗病原微生物的能力，有作为抗生素替代品的潜力（Seyed 等，2018；张家国等，2014）。 微生态制剂中的乳酸菌可黏附（Li等，2018）或定植于水产动物肠道（Iehata 等，2009；王玉堂，2009），调节宿主免疫功能（Nayak，2010），促进营养物质的吸收和利用，还能产生细菌素、有机酸、过氧化氢等物质，可以有效抑制病原菌的生长，从而综合地起到促生长和防病的作用（Zorriehzahra等，2016； 李桂英等，2013）。 乳酸菌细菌素（Bacteriocions）是乳酸菌分泌的一类具有抑菌作用的蛋白质或多肽，对多种病原菌有显著作用，且不易被胃蛋白酶降解，安全性高，因此细菌素及其产生菌在食品工业和食用动物生产领域有良好的应用前景 （O’connor等，2020；Nuria等，2019 ；Moraě canin等，2012）。近年来，细菌素产生菌在水产动物养殖中备受青睐。有报道已证实产细菌素乳酸菌对于水产病原菌具有更好地控制力（Sahoo 等，2014；张之文等，2006）。 有学者分析了水产环境乳酸菌的产细菌素潜力，认为在水产环境中，自然存在大量产细菌素菌株资源（Rather等，2017）。我国发布的新版水产动物饲用乳酸菌筛选标准（T/CSWSL 016-2019）团体标准规定，菌株来自水产动物肠道或养殖水体环境中，或已被批准使用。因此从水产环境中分离产细菌素的菌株，将更有潜力开发为能够在水产养殖中替代抗生素的生物制剂，此类研究也必将成为抗生素替代的一大研究热点。

本研究拟从天津地区的水产动物粪便及其养殖环境中分离适合应用于水产养殖的产细菌素乳酸菌菌株，对其进行鉴定，为水产养殖中抗生素替代性乳酸菌的开发利用提供新思路。

1 试验材料与方法

1.1 试验材料

1.1.1 菌株和试剂 细菌素敏感型指示菌—清酒乳杆菌（Lactobacillus sakei），植物乳杆菌（Lactobacillus plantarum）保存于天津农学院水产学院。该菌株耐酸且对I类细菌素乳酸链球菌素nisin和IIa类细菌素片球菌素PA-1敏感。MRS肉汤和MRS固体培养基，购自北京奥博星生物技术有限责任公司。过氧化氢酶和胃蛋白酶，购自生工生物工程（上海）股份有限公司。1 mol/L的氢氧化钠溶液和1 mol/L的盐酸溶液。

1.1.2 试验仪器设备 HS-1300-U超净工作台（苏净集团苏州安泰空气技术有限公司）；MLS-3020高压蒸汽灭菌锅 （日本sanyan有限公司）；FA2104电子天平（上海舜宇恒平科学仪器有限公司）；YZB-GER 1841-2014高速冷冻离心机（赛默飞世尔科技有限公司）；BINDER-52生化培养箱（安灵）；BA210生物显微镜 （麦克奥迪实业集团有限公司）；Thermofisher4MK2多功能酶标仪。

1.2 试验方法

1.2.1 乳酸菌的分离纯化 收集天津市西青区多个池塘水、底泥和鱼、虾粪便，取样后低温保存立即运送回实验室。取适量样品加入无菌生理盐水中，充分振荡使样本中细菌悬出，进行适当稀释后，取稀释液以倾注法制备含有0.05%碳酸钙的MRS固体平板，30℃倒置培养24 h，无菌挑取有溶钙圈的菌落加入液体MRS中培养12～24 h，待MRS液体悬浊后进一步划线纯化挑取单菌落后备用。

1.2.2 产细菌素菌株初筛 将分离并纯化的菌落于MRS液体培养基，30℃培养24 h。离心（4℃，4025 g，15 min），收集上清液，上清液进一步以0.22 μm滤器过滤得到无菌发酵液。取10 μL无菌发酵液，与90 μL含107cfu/mL指示菌（清酒乳杆菌和植物乳杆菌）的MRS混合，于96孔板中，培养12 h后测定OD600数值。以蒸馏水代替发酵液作为空白对照。初步筛选对指示菌有生长抑制的乳酸菌。

1.2.3 有机酸排除试验 取抑菌试验中有抑菌效果的菌株，以氢氧化钠将其发酵上清的pH中和至6.0后，按1.2.2步骤做抑菌试验，仅以清酒乳杆菌为指示菌，以未调pH的发酵上清为空白对照组，测定各样品OD600数值。

1.2.4 过氧化氢排除试验 取经过有机酸排除试验后依然有抑菌作用的菌株，以氢氧化钠将其发酵上清的pH中和至6.0后，在各菌株上清液中加入过氧化氢酶（终浓度2 mg/mL），在 37℃水浴中温育2 h，按1.2.2步骤做抑菌试验，仅以清酒乳杆菌为指示菌，以未加过氧化氢酶（但加入与过氧化氢酶等体积的生理盐水）的排酸后发酵上清（pH=6）为空白对照组，测定各样品OD600数值。

1.2.5 发酵上清对胃蛋白酶的敏感性 取经有机酸、过氧化氢排除试验后仍有抑菌活性的菌株，以胃蛋白酶（终浓度2 mg/mL）作用1 h，作用时pH为2.0，作用后以氢氧化钠溶液将pH调回至6.0。按1.2.2步骤做抑菌试验，仅以清酒乳杆菌为指示菌，以未加胃蛋白酶（但加入与胃蛋白酶等体积的生理盐水）并经过pH调节至2.0保温1 h后调回至6.0的样品作为空白对照组，测定各样品OD600数值。

1.2.6 16S rDNA菌种鉴定 选取产细菌素且抑菌效果最好的菌株，提取DNA、扩增并测定其16 S rDNA序列（DNA提取、目的片段扩增纯化和测序过程由生工生物工程（上海）有限公司完成）。菌株序列于NCBI网站上进行 BLAST序列比对，并通过MEGA 7.0软件Neighnor-Joining方法构建系统发育树。

1.2.7 抑菌物质对温度的耐受性 离心并过滤，以获得鉴定菌株的无菌发酵上清液，以氢氧化钠溶液调节 pH为6.0，分别在 60、80、100℃水浴、121℃（灭菌锅湿热）恒温处理 30 min，以室温水浴快速冷却至常温后，以清酒乳杆菌为指示菌，如1.2.2所述，测定各组样品的OD600值。以未经高温处理菌株上清液为空白对照组，抑菌活性/%=不同温度处理后菌株OD600值×100/对照组OD600值（未经高温处理菌株）。

表1 菌株来源

1.2.8 抑菌物质对酸碱的耐受性 离心并过滤，以获得鉴定菌株的无菌发酵上清液，分别以盐酸和氢氧化钠溶液调节 pH 为 2.0、4.0、6.0、8.0、10.0，于25℃静置处理1.5 h后，分别以盐酸和氢氧化钠溶液将pH调至6.0。如1.2.2所述，以清酒乳杆菌为指示菌，测定各组样品的OD600值。以未经酸碱处理菌株上清液为空白对照组，抑菌活性/%=酸碱处理后菌株OD600值×100/对照组OD600值（未经酸碱处理菌株）。

1.3 数据处理 试验所得数据利用Excel软件计算得出各组数据的标准偏差；利用ORIGIN 8.0软件绘制柱状图及折线图；利用SPSS软件进行单因素方差分析（SNK，α=0.05或 0.01）。每个试验重复3次，每次重复包含至少3个平行数据。

2 结果与分析

2.1 产细菌素乳酸菌的分离与初步筛选 从天津市西青区多个池塘水、底泥和鱼、虾粪便中分离到产乳酸菌株261株。通过光密度法初步筛选出发酵上清液对清酒乳杆菌和植物乳杆菌有抑菌效果的菌株，其中31株菌对两株指示菌均有抑制作用，菌株来源见表1。

2.2 产细菌素菌株的复筛 在31株菌中，有5株菌 Y2-2、D4-1、D3-2、G7-1、Y7-2 经过中和 pH 至6.0后，发酵上清液对指示菌依然有抑制活性。由图1可知，与自然pH的发酵上清对清酒乳杆菌的抑菌效果相比，菌株Y2-2、D3-2和Y7-2上清液对清酒乳杆菌的抑菌活性分别降低了6.85%、6.45%和8.91%，差异显著 （P＜0.01），说明这些菌株上清液抑菌活性与有机酸有关。菌株D4-1和G7-1的pH=6.0的发酵上清与原始发酵上清抑菌效果降低了0.71%和1.59%，无显著差异（P＞0.05），表明上清液中有非酸性的抑菌物质。

2.3 抑菌物质对过氧化氢酶的敏感性 五株乳酸菌的发酵上清液（pH=6.0）经过氧化氢酶处理前后抑菌率如图2所示。与对照（pH 6.0）相比，经过氧化氢酶处理后，各菌株发酵上清的抑菌效果分别降低了3.28%、3.65%、5.08%、5.07%和 3.42%，均有显著降低（P＜0.05），但仍然有一定的活性。菌株G7-1在排除过氧化氢的作用后抑菌活性依然较高，仍能达到（19±0.99）%的抑菌率。

2.4 抑菌物质对蛋白酶的敏感性 5株菌发酵上清液的抑菌活性对胃蛋白酶的敏感性如图3所示。与未经胃蛋白酶处理但经过过氧化氢酶处理（pH 6.0）的发酵上清相比，菌株Y2-2的抑菌率下降 1.59%，差异不显著（P ＞ 0.05），株菌 D4-1、D3-2、G7-1、Y7-2对清酒乳杆菌的抑菌率分别下降了5.09%、10.00%、21.54%和3.67%，均显著降低（P＜0.05）。其中菌株G7-1在经过胃蛋白酶处理后抑菌率为 （2.7±1.07）%，抑菌活性几乎完全丧失，说明菌株G7-1的上清液中有抑菌的肽或者蛋白质，即细菌素或其类似物。

2.5 抗菌肽对高温的耐受性 从图4可以看出，将菌株G7-1的发酵上清液（经过氧化氢酶处理，pH 6.0）经高温处理后，抑菌活性降低。与对照组相比，经60℃和80℃水浴加热处理30 min后，G7-1的发酵上清液抑菌能力显著降低 （P＜0.05），但仍有（82.68±1.99）%和（67.51±2.10）%的抑菌活性。但经过100℃和120℃加热30 min后，G7-1的发酵上清液的抑菌能力降低到（49.62±4.06）%和（25.93±3.04）%，表明 G7-1 所产抑菌物质对热敏感。

2.6 抗菌肽对酸碱的耐受性 菌株G7-1的发酵上清液（经过氧化氢酶处理，自然pH）对不同pH的酸碱处理后的敏感性如图5所示。酸碱处理对抗菌肽的抑菌活性有一定的影响，pH 6.0的酸处理对抑菌率影响最小，pH 4.0的酸处理使得抑菌活性小幅下降到（87.43±3.71）%，pH 2.0 的处理使得抑菌活性降低到（69.98±4.17）%，表明菌株G7-1所产抗菌肽对酸处理有较好的稳定性和耐受性。相比之下，该抑菌物质对碱处理较为敏感，pH 8.0的碱处理使得抑菌率降低到 （80.13±4.07）%，而pH 10的碱处理使得抑菌率降低到（58.38±2.61）%。不过总体而言，该抗菌肽具有较好的酸碱耐受性。

2.7 菌株G7-1的16S rDNA序列鉴定 根据菌株G7-1的16S rDNA序列信息，综合鉴定产细菌素乳酸菌所属种属为屎肠球菌，命名屎肠球菌G7-1，其系统发育树如图6所示。

3 讨论

本研究从水产养殖环境以及水产动物粪便中分离得到了疑似产细菌素的乳酸菌，鉴定其为屎肠球菌。乳酸菌在水产养殖环境和水产动物中分布十分广泛。Verschuere等（1999）根据水产动物体内的微生物群类分布情况，提出乳酸菌能够增强宿主对疾病抵抗力并且可以提高周围水体质量，是活的微生物添加剂。本研究从水产动物生境及粪便中均能分离出乳酸菌，说明乳酸菌在天津地区水产养殖池塘广泛存在，可能对维持水产动物的微生态平衡有重要作用。

在水产动物生境或体内的乳酸菌种，屎肠球菌是一类常见的乳酸菌，同时具有良好的耐酸和耐低温能力，在极端低温条件下也可以生长（夏锴等，2016；骆艺文，2009）。屎肠球菌组成的微生物菌群不仅有良好的生物学特性，还可以改善机体营养物质的消化吸收，提高动物体免疫能力（Peng等，2010）。屎肠球菌应用在养殖的水产动物也具有很好的效果。例如可显著增加奥尼罗非鱼机体的增长速度和髓过氧化物酶活力 （Wang等，2008）。有报道发现屎肠球菌可以产生肠球菌素P（Class IIa 片球菌素类）、肠球菌素 L50、Q（Class IIb无前导肽类）和肠球菌素B（Class IIc其他线性非片球菌素）等（王涛，2013）。本研究发现的屎肠球菌G7-1菌株产生的类细菌素在胃蛋白酶作用后，抑菌活性显著降低，说明该抑菌物质是蛋白类物质，很可能是Class II类细菌素。细菌素产生能力有助于提高乳酸菌在应用过程中对病原菌的控制力。 Sun等（2012）使用屎肠球菌 MM4（VRE）作为饲料添加剂，饲喂石斑鱼发现，其能显著提高肠道中潜在益生菌的生长，能够对抗金黄色葡萄球菌、哈维弧菌等细菌性疾病。因此进一步分析和考察本研究所分离得到的菌株屎肠球菌G7-1对各类水产品的攻毒保护作用效果，有助于评估屎肠球菌G7-1在水产养殖中替代抗生素的潜力。

4 小结

本试验从水产动物的肠道内容物、粪便以及水产动物养殖环境（包括水、池塘底泥、过滤系统等）分离出菌株261株，在排除有机酸、过氧化氢酶的作用后，经胃蛋白酶作用，确定菌株G7-1能产生蛋白质类抑菌物质。该物质对酸处理有较好耐受性，对碱处理及热处理不稳定。经过16S rDNA序列特征分析，鉴定该菌株为屎肠球菌。