含双酚酸链节聚芳醚砜对过氧化氢酶的固定化

刘 莹 莹， 王 大 鸷， 张 绍 印

( 大连工业大学 轻工与化学工程学院, 辽宁 大连 116034 )

0 引 言

过氧化氢酶具有催化专一、反应条件温和等特点，在工业领域都具有较广泛的应用[1-3]。游离酶稳定性差，对环境变化十分敏感，难以重复使用，反应后产物的分离、纯化以及酶的回收都非常困难，导致生产成本高，在一定程度上限制了过氧化氢酶的工业应用。将酶固定在合适的载体上可能会解决上述问题[4]。因此，对酶的固定化研究是酶工程研究的核心内容之一。国内外研究学者对于过氧化氢酶的固定化已经做了大量的研究。陈爽等[5]用Fe(Ⅲ)改性胶原蛋白固定化过氧化氢酶，固定化酶重复性较好，重复使用25次仍能保持50%的相对酶活力，但由于胶原蛋白不易保存等缺点，还未见大批量的工业化应用。

聚芳醚砜[6]作为固定化酶载体的优点在于性质稳定，耐酸、碱，多孔等，此外，聚芳醚砜具有多种功能基团，如—COOH、—NH2、—SO3H等，这些基团都可帮助载体固定酶。聚芳醚砜载体由含羧基的可再生资源双酚酸制备，不仅成本低、易于分离，而且聚合物引入的羧基与酶的非活性位点有良好的吸附性。课题组在前期研究发现含羧酸钠基功能性基团[7]的聚芳醚砜(PAES-C-Na)对单一的金属离子具有优异的吸附性能。本实验对聚芳醚砜通过PVPK90改性，吸附金属离子，再固定吸附酶，并对固定化酶和游离酶的活性进行了对比研究。

1 实 验

1.1 材 料

聚芳醚砜，实验室自制；过氧化氢酶；硫酸铜、二甲基亚砜、磷酸氢二钠、磷酸二氢钠、30%过氧化氢，分析纯。

1.2 实验方法

1.2.1 聚芳醚砜载体改性

一定量的聚乙烯吡咯烷酮(PVP)与聚芳醚砜置于250 mL锥形瓶中，加入适量的二甲基亚砜，加热溶解后滴进热水中，形成球状固体，并于沸水中反复煮6～7次，最后在100 ℃条件下真空干燥12 h以上。制成多孔载体后吸附Cu2+，即得到改性后的聚芳醚砜多孔载体。

1.2.2 改性后的聚芳醚砜载体固定过氧化氢酶

将50.0 mg改性后的聚芳醚砜多孔载体置于5 mL体积分数为0.25 mL/mL的过氧化氢酶液中，150 r/min摇床反应6 h。反应结束后，过滤并用pH为7.0的磷酸盐缓冲溶液冲洗3～4次以除去多余的酶液，得到以聚芳醚砜为载体的固定化过氧化氢酶[8]。

1.3 分析方法

1.3.1 游离过氧化氢酶的酶活力测定

采用分光光度法[9]于25 ℃测定游离过氧化氢的酶活。反应液总体积为3 mL，含0.1 mL酶液和2.9 mL含有1 mol/L H2O2的50 mmol/L的磷酸氢二钠、磷酸二氢钠缓冲溶液(pH 7.0)，在过氧化氢特征吸收波长240 nm处测定吸光度变化。过氧化氢酶的酶活力定义为：25 ℃时每分钟分解1 μmol H2O2所需的酶量。

1.3.2 固定化过氧化氢酶的酶活力测定

准确称取100.0 mg固定化过氧化氢酶加到1 mol/L H2O2的50 mmol/L的磷酸氢二钠、磷酸二氢钠缓冲溶液(pH 7.0)中，反应1 min后过滤取出固定化酶，在过氧化氢特征吸收波长240 nm 处测定吸光度变化，求得固定化酶活。

1.3.3 固定化过氧化氢酶回收率及吸附率

固定化过氧化氢酶回收率和吸附率按公式计算[10]。

2 结果与讨论

2.1 固定化酶的最适反应温度

将制备的固定化过氧化氢酶和游离酶分别置于pH为7.0磷酸盐缓冲溶液配置的0.1 mol/L H2O2溶液中，在不同温度下保存10 min，测定酶活力，结果如图1所示。固定化过氧化氢酶较游离酶表现出了更高的相对酶活力，当温度达到50 ℃ 时，固定化酶仍可保持原有酶活力的90%以上，而游离酶到了50 ℃酶活力明显下降。过氧化氢酶固定化后对温度的敏感性降低，并可在更广泛的温度范围内表现有较高的催化活力。

图1 游离酶及固定化酶的最适反应温度

2.2 固定化酶的最适反应pH

将制备的固定化过氧化氢酶和游离酶分别置于pH为7.0磷酸盐缓冲溶液配置的0.1 mol/L H2O2溶液中，在35 ℃保存10 min，测定酶活力，结果如图2所示。固定化过氧化氢酶在所考察的pH范围内较游离酶表现出了更高的相对酶活力，当pH在5.0～9.0内，固定化酶与游离酶都表现出了较好的酶活力，酶活力都在90%以上。过氧化氢酶固定化后可在较宽泛的pH范围内应用，并且表现出较高的催化活力。

图2 游离酶及固定化酶的最适反应pH

2.3 固定化酶的酸碱稳定性

将制备的固定化过氧化氢酶置于不同pH(5.0～9.0)的磷酸盐缓冲溶液中，室温保存5 h，测定酶活力。在同等条件下测定游离酶的pH稳定性作为对照，结果如图3所示。固定化过氧化氢酶和游离酶在不同pH下保存相同时间，固定化过氧化氢酶表现出了更好的pH稳定性，固定化过氧化氢酶在酸、碱条件下依旧能保持80%以上的原有酶活力，而游离酶在酸、碱条件下酶活都低于40%。过氧化氢酶经固定化后，更耐酸、碱，大大提高其在工业生产中的应用范围。

图3 游离酶及固定化酶的酸碱稳定性

2.4 固定化酶的热稳定性

将制备的固定化过氧化氢酶置于不同pH为7.0的磷酸盐缓冲溶液中，在35和55 ℃下保存30、60、90、120 min后，测定固定化酶在低温、高温保存不同时间的活力变化。在同等条件下测定游离酶的热稳定性作为对照。由表1可见，在考察的两个不同温度并保存不同时间下，固定化过氧化氢酶表现出了更高的热稳定性。

表1 游离酶及固定化酶在35 和55 ℃的热稳定性

2.5 固定化酶的贮藏稳定性

在考察固定化过氧化氢的贮藏稳定性时，将制备的固定化过氧化氢酶置于空气中，另取等量游离酶溶于pH为7.0的磷酸盐缓冲溶液中，分别放置在4和25 ℃下保存28 d，每隔7 d测其酶活力，结果如表2所示。由表2可见，固定化过氧化氢酶表现出了更好的贮藏稳定性。固定化酶在4 ℃贮藏保存时间更久，相对酶活力更高，在第28天仍能保持60%左右酶活力，游离酶相对酶活力仅有20%。固化酶在25 ℃保存第28天也有30%左右酶活力，游离酶几乎在第21天就已完全失活。这说明无论在低温或是室温条件下，固定化酶都比游离酶有更稳定的贮藏稳定性。

表2 游离酶及固定化酶在4和25 ℃的贮藏稳定性

2.6 固定化酶的重复使用性

将改性的聚芳醚砜载体分别吸附金属离子和过氧化氢酶，制备好的固定化过氧化氢酶分别置于35 ℃水浴摇床中，通过测量过氧化氢吸光度计算酶活力变化，结果如图4所示。经改性的聚芳醚砜载体连续催化过氧化氢分解反应20次后，酶活力仍可保持在50%左右，前10次的反应中酶活力无明显下降，直至完全失活可连续反应25次以上，显示出了该固定化酶良好的重复使用性，并且载体可回收重复固定化酶，不会造成载体损失。

图4 固定化酶的重复使用性

2.7 固定化酶的二次重复使用性

将重复使用过25次后的载体再次重复固定化步骤，即分别吸附金属离子和过氧化氢酶酶，将制备好的固定化过氧化氢酶分别置于35 ℃水浴摇床中，通过测量过氧化氢酶吸光度计算酶活力变化。由图5可见，载体经使用了25次后，再次固定过氧化氢酶仍可表现出良好的重复使用性，其中，先吸附金属离子再固定化酶的方法比只固定化酶的方法表现出更好的重复使用性。连续催化过氧化氢分解反应20次后，酶活力仍可保持在50%左右，前10次的反应中酶活力无明显下降，直至完全失活可连续反应25次以上，和第一次重复使用性几乎没有差别，进一步说明了载体不会损失，表现出较好的重复使用性。

图5 固定化酶的二次重复使用性

3 结 论

聚芳醚砜具有化学性质稳定、耐酸碱、耐高温等优良性质。Cu(Ⅱ)作用改性后的聚芳醚砜为载体固定过氧化氢酶，使得该载体使用周期大大增强。过氧化氢酶经此方法固定后表现出了良好的热稳定性、酸碱稳定性、操作稳定性以及贮藏稳定性。固定化酶的反应pH和反应温度适用范围均有明显的提高。值得注意的是，与其他固定化过氧化氢酶载体相比较，以Cu(Ⅱ)作用改性后的聚芳醚砜为载体有更好的操作稳定性，且酶活吸附率和酶活回收率都大大提高。