精子正常形态率、顶体完整率及顶体反应率与补救ICSI结局相关性研究

陈其桂，李大文*，谭卫红，成俊萍，薛林涛，李金燕，何泳志，庞太森，韦福，黄泰帅

(1.广西医科大学，南宁 530021；2.广西壮族自治区人民医院生殖医学与遗传中心，南宁 530021；3.桂林医学院，桂林 541004；4.广西壮族自治区妇幼保健院生殖中心，南宁 530003)

在体外受精-胚胎移植(IVF-ET)中，大部分生殖中心的受精率约70～80%[1]。在某些情况下，低受精或受精完全失败可能与促排卵刺激方案、女性体内激素水平相关。另一方面，精卵相互作用异常也是其缘由之一[2]。研究指出，发生IVF完全受精失败的概率约3%～5%[3]，受精失败会给患者带来情感与经济的双重打击。补救卵胞浆内单精子注射术(R-ICSI)是在常规IVF-ET失败后避免周期取消而实施的助孕技术，由Nagy等[4]在1993年提出并实施，使无数患者受孕。尽管目前补救ICSI取得了不错的成绩，但仍存在诸多问题，如助孕技术难题未完全解决、受精率及临床妊娠率低下等[5]。且对补救ICSI妊娠结局的影响因素也没有一致的研究，本研究依据妊娠状况将补救ICSI患者分为妊娠组及未妊娠组，对精子正常形态率、顶体完整率及顶体反应率与补救ICSI结局相关性进行分析，进而优化治疗方案，给实施补救ICSI助孕技术前确立可靠的预测指标，以期提高临床妊娠率。

资料和方法

一、研究对象

回顾性分析2014年1月至2018年12月在广西壮族自治区人民医院生殖医学与遗传中心行常规IVF-ET失败而进行补救ICSI治疗的125对不孕夫妇临床资料，男方平均年龄(34.42±5.22)岁，女方平均年龄(31.90±3.31)岁。

纳入标准：(1)女方年龄<38岁；(2)第一次新鲜胚胎移植周期；(3)女方彩超检查提示卵巢功能无异常；(4)夫妇双方无性传播疾病、无遗传性疾病史；(5)夫妇双方染色体无异常；(6)使用控制性超排卵长方案。

排除标准：(1)男方服用影响精子生成及精子活力的药物；(2)男方先天畸形、睾丸萎缩(包括附睾)、生殖系统感染；(3)女方子宫腺肌症、子宫内膜异位症、多囊卵巢综合征等因素。

根据临床妊娠结局将125对夫妇分为两组：妊娠组(n=56)和未妊娠组(n=69)。

二、研究方法

1.促排卵方案：采用GnRH激动剂(达菲林，益普生，法国)/FSH(果纳芬，雪兰诺，瑞士)和(或)人绝经期促性腺激素(HMG，珠海丽珠医药)/HCG(雪兰诺，瑞士) 长方案促排卵。从用促性腺激素(Gn)4 d后开始B超监测卵泡发育，当有2个卵泡直径大于18 mm时，当晚9：00左右予HCG 10 000 U肌肉注射，36 h后取卵。

2.精液采集：男性患者禁欲2～7 d，手淫法取精液置于干燥消毒量杯内，标本被转送到实验室过程中，保持在20～37℃，置于37℃恒温箱内液化。

3.精液常规检测：IVF失败前进行。通过称重收集量器中的精液来测量精液体积；使用计算机精子辅助分析(CASA)系统测定精子密度、活力及各项参考值。参考《人类精液检查与处理实验室手册》第 5 版，精液体积参考值为≥1.5 ml；精子浓度≥15×106/ml或一次射精总数≥39×106/ml；前向运动精子(PR)≥32%。

4.精子正常形态率判定：IVF失败前进行。本中心采用WHO推荐的Diff-Quik快速染色方法(Microptic，西班牙)精液涂片进行染色。只有精子头、颈、中段和尾部均正常的精子才认为是正常精子。至少计数 200个精子，确定正常精子的形态率。

5.精子顶体完整率及顶体反应率判定：在IVF失败前进行。按照Sigma公司的试剂盒操作说明书进行。采用密度梯度离心法+上游法处理液化好的精液，取10 μl精子悬液均匀涂抹在干净的载玻片上，自然干燥后置于95%乙醇中固定30 min，再次干燥完毕后置于PSA工作液中，4℃避光反应8～12 h，反应结束后取出玻片，用去离子水轻微冲洗、干燥并避光保存，荧光显微镜450～490 nm激发光下油镜观察涂片。利用血细胞计数器计数400条以上精子，统计顶体完整精子数、顶体不完整精子数以及自发顶体发生数。顶体完整率=顶体完整精子总数/检测精子总数×100%，自发顶体发生率=自发顶体发生数/检测精子总数×100%。

6.补救ICSI适应症及治疗：以第二极体作为早期受精的判断标准，受精6 h观察，若患者所有成熟卵母细胞中出现明确第二极体的比例<30%，建议行补救ICSI。对未排出第二极体的卵母细胞于受精6～8 h后再次观察，如仍未排出第二极体，于当晚行补救ICSI治疗方案。

7.受精、卵裂及胚胎移植：常规行补救ICSI，治疗后第1天观察卵母细胞受精情况，以双原核(2PN)卵母细胞作为正常受精卵。第3天按照Peter分级标准选择优质胚胎进行移植，移植胚胎数≤3个，剩余Ⅲ级以上胚胎予冷冻保存，并给予黄体支持。

8.妊娠判定及随访：移植术后第14天测血β-HCG水平，β-HCG>10 U/L为阳性。移植后第28天和第42天B超检查了解胚胎发育情况，若B超见宫腔内孕囊及心管博动则确立为宫内妊娠；黄体支持自妊娠8周起逐渐减量至妊娠10周停用。随访至妊娠12周转入产科门诊建档立卡及定期产检。我科进行电话随访直至胎儿出生并记录。

9.观察指标：受精率=受精卵母细胞数/卵母细胞数×100%；卵裂率=卵裂数/受精卵母细胞数×100%；优胚率=优质胚胎数/卵裂数×100%；临床妊娠率=临床妊娠例数/移植周期例数×100%；活产率=活婴分娩数/移植周期例数×100%；单胎率=单胎例数/临床妊娠例数×100%；双胎率=双胎例数/临床妊娠例数×100%；早产率=早产例数/临床妊娠例数×100%；流产率=流产例数/临床妊娠例数×100%。

三、统计学处理

结 果

一、患者一般情况比较

两组患者不孕年限、男方年龄、女方年龄、基础FSH值及窦卵泡数均无显著性差异(P>0.05)(表1)。

表1 两组患者一般情况比较[M(min，max)]

二、两组患者的精液质量比较

统计结果显示，两组患者的精液量、精子浓度、精子总数、前向运动精子百分率、精子正常形态率、精子顶体完整率及精子顶体反应率上均无显著差异(P>0.05)(表2)。

三、促排卵及胚胎移植情况比较

两组患者HCG日子宫内膜厚度、获卵数、可移植胚胎数、移植胚胎数、补救ICSI受精率、卵裂率、优胚率均无显著差异(P>0.05)，但妊娠组的优质胚胎数显著高于未妊娠组(P<0.05)(表3)。

表2 两组患者的精液相关参数[(-±s)，M(min，max)]

表3 促排卵及补救ICSI治疗相关参数比较[M(min，max)]

四、精子正常形态率、顶体完整率及顶体反应率与受精率、卵裂率、优胚率相关性分析

Spearman等级相关分析结果显示，精子正常形态率与受精率、卵裂率存在显著相关性(P<0.05)，与优胚率无显著相关性(P>0.05)；精子顶体完整率与优胚率存在显著相关性(P<0.05)，与受精率、卵裂率均无显著相关性(P>0.05)；精子顶体反应率与受精率、卵裂率及优胚率均无显著相关性(P>0.05)(表4)。

表4 Spearman等级相关分析

五、补救ICSI周期的妊娠结局情况

在125个补救ICSI周期中，临床妊娠56例，临床妊娠率为44.80%(56/125)；活产分娩数49例，活产率为39.20%(49/125)，其中单胎31例，单胎率为55.36%，双胎18例，双胎率为32.14%；早产11例，早产率为19.64%(11/46)；流产6例，流产率为10.71%(6/56)；异位妊娠1例。妊娠结局较好。

讨 论

补救ICSI从提出发展到如今，已被广泛应用，并获得不错的妊娠结局，早期补救ICSI可作为常规IVF失败时的一种安全有效的补救方法[6]。同时，早期补救ICSI相较于晚期补救ICSI的胚胎发育和临床结局更佳，更值得推荐，可作为IVF受精失败或受精率不高者有效挽救计划[7]。本研究发现补救ICSI周期妊娠组的优质胚胎数显著高于未妊娠组，提示优质胚胎数多有利于补救ICSI周期临床妊娠。这可能是由于当获得的优质胚胎数目充分时，具有良好发育潜能的优质胚胎多，胚胎实验室专家优中选优，进而挑选质量更好的胚胎进行移植，降低了妊娠失败率。

男性的生育力可通过精子形态这一重要指标来得到反映[8]，已有研究报道辅助生殖技术对于畸形精子症患者具有显著疗效，可获得较高的临床妊娠率[9]。Chen等[10]研究发现，精子畸形是导致常规IVF失败的重要缘由，精子正常形态率<4%可显著增加受精失败率。另有研究指出在IVF周期中正常受精与精子形态异常没有相关性，但畸形精子症患者组临床妊娠率较正常组患者降低[11]。刘闯等[12]探讨了精子正常形态率与IVF周期D3优胚的囊胚形成率与囊胚质量的相关性，结果发现精子正常形态率与优质囊胚形成率呈正相关，但并不影响总体囊胚形成。Younes等[13]研究指出，当精子正常形态率<4%，应优先选择ICSI作为一线治疗方案，因为在此情况下ICSI周期在受精率、卵裂率、胚胎质量及囊胚质量等方面均优于IVF周期。Li等[14]探讨了精子形态对补救ICSI周期临床结局的影响，结果发现妊娠组与非妊娠组患者在受精率、卵裂率、优胚率、可移植胚胎率、临床妊娠率、流产率等方面均无显著差异。本研究发现在补救ICSI周期中，妊娠组与未妊娠组患者精子正常形态率无显著差异，但精子正常形态率与受精率呈正相关，与卵裂率呈负相关。表明随着精子正常形态率增加，受精胚胎数目增加，受精率升高，而卵裂率下降。这可能是由于当精子形态正常时，尤其是头部形态正常，其顶体更为完整，顶体酶活性更佳，精子核DNA完好，精子整体质量及精子活力更好，前向运动力更强，同时卵子激活过程与精子顶体反应密切相关[15]，这更有助于精卵之间的相互结合，推动受精过程的发生，受精率得以提高。一般来说，卵裂率随着精子正常形态率增加而增加，但在我们的研究中发现精子正常形态率与卵裂率呈负相关，这可能因为在补救ICSI中，卵裂率受到其他多种不稳定因素的影响更大，如精子DNA损伤、染色体异常、活性氧水平[16]、生殖系统炎症、男性不良生活习惯及环境污染等，同时操作过程中技术人员不熟练也会形成干扰。具体原因尚不明确，仍需进一步研究讨论。

精子顶体的完整性是体外受精助孕成功的关键之一。顶体结构不完整容易导致顶体反应发生障碍，影响受精，甚至导致男性不育。精子功能可通过精子顶体完整率体现，与IVF受精率有相关性[17]。顶体不完整性通常包括顶体缺乏、顶体薄、体积小、囊泡顶体及无内容物等。孟祥黔等[18]研究指出空泡精子对ICSI患者胚胎发育及临床结局无明显影响，但由于样本量不足结论并不确切。另外精子顶体有多种异常形态，临床较为常见的为圆头精子，异常形态的顶体结构常出现顶体和核膜分离，双层膜结构部分消失，顶体反转和核分离现象。Zahiri等[19]对其与体外受精结局的相关性做了研究，发现精子不同顶体形态(大、小、无顶体)可能与染色质完整性呈负相关，可使精子的生育潜能下降，导致受孕率降低。何泳志等[20]发现在补救ICSI周期中，未妊娠组顶体完整率较妊娠组低，提示如果精子顶体更为完整时，可获得更好的妊娠结局，但与受精率、卵裂率、优胚率相关性并不明显。本研究发现补救ICSI周期中妊娠组与未妊娠组患者间精子顶体完整率无显著性差异，但是精子顶体完整率与补救ICSI优胚率呈正相关。这可能是由于在受精过程中，发生顶体反应的前提要求是保持顶体完整性，顶体反应释放了顶体内容物中的大量水解酶并激活了精卵细胞相互融合的功能，是受精的前提和保证。顶体内含有多种水解酶(如透明质酸酶、顶体蛋白酶等)，与受精密切相关，影响精子与卵母细胞融合，对于体外受精结局的影响是至关重要的[21]。当精子顶体缺损时，临床结局就会不理想。

精子顶体反应是膜融合、水解酶及基质蛋白释放的生理分泌过程，它使精子能够穿透卵母细胞。不稳定的顶体状态、顶体反应不足或顶体酶活性不足都可能损害精子的受精能力。顶体反应包括激活受体、膜结合、酶释放以及透明带水解等复杂过程，由钙离子调节。有研究指出当精子自发顶体反应率≥9.52%或精子自发顶体反应率≥9.52%及顶体酶活性<25 μIU/106时，应优先倡议行早期补救ICSI或直接行ICSI助孕[22]，可得到更好的临床妊娠结局。肖鑫等[23]探讨精液质量对IVF与补救ICSI周期结局的影响，发现当顶体反应率<15.7%时，补救ICSI助孕技术可降低受精失败率。本研究中两组患者的精子顶体反应率无显著差异，且与受精率、卵裂率、优胚率亦无相关性。这可能是由于精子顶体在受精前因某些因素影响而诱发了自身顶体反应，或者本研究样本量纳入不足导致差异无显著统计学意义，具体原因有待进一步探讨。

本研究纳入的125个补救ICSI周期中，临床妊娠56例，活产分娩数49例，单胎31例，双胎18例；早产11例，流产6例，异位妊娠1例。结果初步表明补救ICSI是IVF受精失败后不错的选择方案，它可以避免周期取消，给患者提供了再次妊娠的机会，且早期补救ICSI方案更值得推荐应用[24]。但是，目前关于精子正常形态率、顶体完整率及顶体反应率与补救ICSI结局相关性研究尚不足，以后研究中需将更多临床数据纳入研究分析，方可得出更为确切的结论。