DNA-Cu(II)复合物应用于粮食中铜的检测

王素利，费华熙，周灿，叶宸志，蒋文苹

(重庆食品工业研究所，重庆，400042)

铜是人体必需的微量元素，对维持人体正常的生理功能具有重要作用[1]。铜在机体内多以含铜蛋白的形式存在，参与免疫反应、神经功能、骨骼代谢、造血系统、抗氧化功能等一系列活动[2]。当铜摄入量过低时，可能会引起冠心病或骨质疏松症等疾病的发生；但过量摄入则可能造成肠道紊乱，以及大脑、肝脏、肾脏的损伤，甚至引发阿尔茨海默病、帕金森症等[3],因此检测食品中的铜含量十分必要。

目前食品中铜含量的测定方法主要有石墨炉原子吸收光谱法(graphite furnace atomic absorption spectrometry，GFAAS)[4-5]、火焰原子吸收光谱法(flame atomic absorption spectrophotometry，FAAS)[6-8]、电感耦合等离子体质谱法(inductively coupled plasma mass spectrometry，ICP-MS)[9-10]、电感耦合等离子体发射光谱法(inductively coupled plasma optical emission spectrometry，ICP-OES)[11-13]等。这些方法虽然检测结果准确、可信度高，但需要昂贵的大型精密仪器，对分析实验室和操作人员的要求较高，难以满足小规模企业日常生产监测的需要。因此开发出一种简单易行、操作方便、结果准确的铜检测方法具有十分重要的意义。比色检测法因其操作简单方便、检测成本低、检测结果可用肉眼判断等优点，而备受研究人员的关注[14-15]。

GHODAKE等[16]发现，Cu2+与酪蛋白肽功能化的Ag纳米颗粒发生配位反应，可使得Ag纳米颗粒产生集聚，导致溶液颜色由黄色变为红色，由此开发了一种Cu2+的比色检测方法。吴亮亮等[17]通过对Ag/Pt纳米簇的表面修饰调控其催化活性，建立了一种高灵敏的比色法检测Cu2+。梅晓宏等[18]建立了一种基于双重脱氧核酶的生物传感器，可实现Cu2+的裸眼可视化检测。LI等[19]利用Cu2+与特殊序列的DNA的配位作用构建了具有类过氧化物酶活性的DNA-Cu(II)复合物，以此催化3,3′,5,5′-四甲基联苯胺(3,3′,5,5′-tetramethylbenzidine, TMB)-H2O2发生显色反应，进而实现Cu2+的可视化检测。

目前，文献中建立的Cu2+比色检测方法多数用于水样品中Cu2+的检测[16-19]，应用范围有限或者仅处于研究开发阶段。因此，考察新开发的检测方法能否适用于复杂基体中Cu的检测，扩大其应用范围具有重要的实际意义。本文在已有文献研究[19]的基础上，采用干法灰化法对粮食样品进行预处理，考察DNA-Cu(II)复合物应用于粮食中Cu的检测的可行性。

1 材料与方法

1.1 主要仪器与设备

ELX-800酶标仪，BioTek；TAS-990原子吸收分光光度计，北京普析通用公司；UPTA-20超纯水机，邦西仪器科技有限公司；SHH-250L恒温培养箱，重庆市永生实验仪器厂；高速台式离心机，北京京立离心机有限公司；XMTD-6000恒温水浴锅，北京长风仪器仪表公司；JA3003A电子分析天平，上海精天电子仪器有限公司；DL-1电炉，北京中兴伟业世纪仪器有限公司；SX2-12-10Z箱式电阻炉，上海博迅实业有限公司医疗设备厂。

本实验所用玻璃器皿、坩埚等均用体积分数20% HNO3溶液浸泡过夜，自来水反复冲洗后，用一级水冲洗干净。

1.2 主要材料与试剂

GBW(E)100195小麦粉有证标准物质、GBW(E)100196玉米粉有证标准物质、GBW(E)100194大米粉有证标准物质、GBW10055大豆粉有证标准物质，中国计量科学研究院；10种粮食样品购自重庆某超市。

一级水(符合GB/T 6682—2008一级水要求)，自制；盐酸(优级纯)、H2O2(30%，分析纯)，重庆川东化工(集团)有限公司；KH2PO4(分析纯)，成都市科隆化学品有限公司；Cu、Cr、Ni、Zn、Pb、Ca、Mn标准溶液(1 000 mg/L)，Inorganic Ventures；Ma、Cd,标准溶液(1 000 mg/L)、Al标准溶液(100 mg/L),K、Fe、Mg标准溶液(1 000 mg/L)，中国计量科学研究院国家有色金属及电子材料分析测试中心；TMB(纯度≥99.0%)DNA核酸序列RET1：A(G4C)3G5C、RET2：GC5(GC4)3T(ULTRAPAGE纯化)，生工生物工程(上海)股份有限公司。

DNA溶液的配制：将DNA冻干粉用一级水漩涡振荡溶解，取等量的RET1溶液和RET2溶液混合，经退火后，形成双螺旋结构(RET1-RET2)，双链DNA配制浓度为50 μmol/L；缓冲溶液为100 g/L KH2PO4溶液；TMB溶液为5 mmol/L乙醇溶液。

1.3 实验方法

1.3.1 Cu2+的检测

向微孔板中依次加入100 μL缓冲溶液、20 μL DNA溶液、20 μL不同质量浓度的Cu2+标准溶液，轻轻振荡混匀；再加入20 μL TMB溶液，混匀后加入20 μL H2O2，振荡混匀后，25 ℃避光环境反应30 min，用酶标仪进行630 nm/450 nm双波长检测，测定各孔吸光度。

1.3.2 选择性和干扰性实验

选择性实验：用10倍浓度的其他常见金属离子Na+、K+、Cr3+、Cd2+、Al3+、Ni2+、Zn2+、Pb2+、Fe3+、Ca2+、Mg2+、Mn2+(4.0 μg/mL)代替上述Cu2+检测方法加入的0.4 μg/mL Cu2+，其他步骤同1.3.1，考察该方法的选择性。

干扰性实验：将一定量的其他常见金属离子Na+、K+、Cr3+、Cd2+、Al3+、Ni2+、Zn2+、Pb2+、Fe3+、Ca2+、Mg2+、Mn2+标准溶液分别与Cu2+标准溶液混合，配制成Cu2+质量浓度为0.4 μg/mL，其他金属离子质量浓度为4.0 μg/mL的混合离子溶液。将混合离子溶液代替上述Cu2+检测方法加入的Cu2+标准溶液，其他步骤同1.3.1，考察在有其他离子存在下该方法的抗干扰能力。

1.3.3 实际粮食样品分析

称取粉碎后试样0.5～5 g(精确至0.001 g)于坩埚中，将坩埚置于电炉上以小火加热使试样充分炭化至无烟，然后置于高温炉中，在(550±25)℃灼烧4 h。冷却取出，对于灰化不彻底的试样，加数滴HNO3，小火蒸干后，再转入高温炉中继续灼烧，至试样呈白灰状，冷却后取出，用1 mL体积分数50% HCl溶液溶解并转移至25 mL比色管中，用一级水定容至25 mL刻度线,同时做试剂空白试验。

在与1.3.1相同的实验条件下，将Cu2+标准品溶液替换为空白溶液和试样溶液，测定吸光度。以标准系列溶液中Cu的质量浓度为横坐标，以相应的吸光度值为纵坐标，绘制标准曲线。根据回归方程计算出样品中Cu的浓度。检测过程中Cu2+浓度需在标准曲线的浓度范围内，如超过标准曲线最大浓度，需稀释后重新测定。

2 结果与分析

2.1 标准曲线的建立

在实验条件下，测定不同Cu2+质量浓度下反应体系的吸光度值，Cu2+质量浓度在0～1.0 μg/mL范围内与反应体系所测吸光度值符合二次函数关系，曲线回归方程为：y=-0.173 5x2+0.431 6x+0.004 1，R2=0.998。

2.2 检出限的确定

平行测定20次空白值，计算出吸光度值的标准偏差，将3倍的标准偏差代入标准曲线，计算出相对应的浓度，即为检出限。由此计算出本方法的检出限为0.01 μg/mL，当称样量为1.0 g，定容体积为25 mL时，方法的检出限为0.25 mg/kg，与GB 5009.13—2017《食品安全国家标准 食品中铜的测定》[20]第二法火焰原子吸收光谱法中的检出限相当。

2.3 选择性和干扰性实验结果分析

如图1-a所示，在反应条件下，高浓度的其他金属离子的吸光度值远小于Cu2+，这说明该反应体系对于Cu2+具有特定的识别能力。干扰性实验结果如图1-b所示，在10倍浓度其他离子存在的情况下，反应后的吸光度值相对单独的Cu2+并未发生显著性变化，说明该反应体系具有较强的抗干扰能力。

a-金属离子(质量浓度为4.0 μg/mL)反应后吸光度值b-混合离子(含0.4 μg/mL Cu2+和4.0 μg/mL其他金属离子)反应后吸光度值图1 选择性和干扰性实验结果Fig.1 Results of selectivity and interference

2.4 准确性实验结果

选取10种常见粮食样本(大米、小米、小麦、玉米、红豆、燕麦、花生、大豆、芝麻、土豆)，各样本分别加入适当不同质量浓度的Cu标准物质，作为低、中、高值的阳性样本。前处理过程相同，采用本实验方法与GB 5009.13—2017《食品安全国家标准 食品中铜的测定》[20]中第二法火焰原子吸收光谱法进行对比实验。同一样品平行测定3次，取其平均值作为检测结果，检测结果见表1。

采用配对t检验法比较2种方法的检测结果是否存在显著性差异[21]。在95%的置信度下，计算得到tD= 0.226，查t分布表可知，t0.05,29=2.045，tD

2.5 精密度实验结果

使用本实验方法分别对小麦粉、玉米粉、大米粉、大豆粉有证标准物质进行6次重复测定，考察本方法的精密度。实验结果见表2。

表1 本方法与火焰原子吸收法测定结果比较Table 1 Comparison between the results of this method and FAAS

表2 精密度实验数据Table 2 The test results of precision

根据GB/T 27404—2008[22]附录F：检测方法确认的技术要求规定，被测组分含量在0.1～1 mg/kg时，实验室内变异系数≤ 11%；被测组分含量在1～10 mg/kg时，实验室内变异系数≤ 7.5%，被测组分含量在10～100 mg/kg时，实验室内变异系数≤5.3%。真值含量在0.01～10 mg/kg时，测定含量平均值与真值的偏差指导范围为-20%～+10%。本实验方法测量结果能够满足上述要求。

另外，NY 861—2004[23]规定谷物及制品中Cu的限量≤10 mg/kg，豆类及制品中、薯类制品中Cu的限量≤20 mg/kg，鲜薯类中Cu的限量≤6 mg/kg。当称样量为1.0 g，定容体积为25 mL时，上述最大限量对应的Cu2+的质量浓度分别为0.4、0.8、0.24 μg/mL。本实验方法测量范围能够满足上述要求。

若无酶标仪设备，也可采用目测法进行半定量判定，即将反应后的样品比色杯与标准点比对，得到样品溶液的近似浓度，进而计算出样品中Cu的大致含量，可用于对大批量样品进行快速筛查。

3 结论

基于DNA-Cu(II)复合物的类过氧化物酶活性，本文采用干法灰化法对粮食样品进行预处理，建立了粮食中Cu的比色检测方法。通过对标准曲线、检出限、准确性、精密度等的考察，证实了该比色检测方法应用于粮食中Cu含量检测的可行性。但此方法能否适用于基质更加复杂的样品尚未可知，今后工作拟考察该方法应用于果蔬样品、动物性食品等各类样品中Cu含量检测的可行性，以期进一步扩大其适用范围。