泡菜水品质和细菌类群的关联性

郭壮，吴璞颖，赵楠，张振东，侯强川*

1(湖北文理学院 食品科学技术学院，湖北 襄阳，441053)2(四川省农业科学院 农产品加工研究所，四川 成都，610066)

安康地区的酸菜又称“浆水酸菜”，以当地特有红皮萝卜(RedRaphanussativus)缨为主料，辅以小葱或韭菜发酵而成。发酵不仅有效延长了蔬菜的食用期，更赋予了泡菜与所使用原料完全不同的独特风味[1]，期间微生物的代谢活动是泡菜风味品质形成的最为重要因素[2]。近年来，研究人员系统解析了四川[3]、山西[4]和东北地区[5]泡菜的微生物类群，证实乳酸菌是泡菜发酵过程中的优势菌。研究显示，地理距离越远、环境差异越大，不同地区发酵食品的微生物类群构成差异亦越大[6]。特殊的地理环境和原料是否赋予了安康地区泡菜较为独特的微生物类群，值得进一步研究。

作为仿生学技术，电子舌和电子鼻对一类味觉或嗅觉化合物具有整体选择性，体现了各化合物之间相互作用的特性，在食品品质评价方面具有一定的技术优势，得到了广泛应用[7-8]。研究人员对泡菜中的微生物类群进行解析的根本目的之一在于探讨泡菜风味形成的机制，进而寻求提升泡菜品质的途径[9]。目前针对乳酸菌对泡菜风味影响的研究较多，但更多的局限于乳酸菌单菌种发酵，而对于微生物类群或多株菌相互作用对泡菜品质影响的研究报道尚少[10]。较之纯培养技术和指纹图谱技术，以MiSeq为代表的第二代高通量测序技术的出现，实现了对发酵食品微生物类群更为全面和系统地解析[11]，使探讨微生物类群与泡菜品质的关联性研究成为可能。

本研究首先使用电子舌和电子鼻技术对安康地区泡菜水品质进行评价，继而采用MiSeq测序技术对泡菜水中微生物类群进行解析，最后基于Procrustes分析对泡菜水品质和细菌多样性的关联性进行了研究，以期为我国特色泡菜制品微生物类群的揭示和产品品质特征形成原因，提供数据支撑。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

FastPfu Fly DNA Polymerase、dNTPs Mix、FastPfu Buffer，北京全式金生物技术有限公司；参比溶液、极性溶液、味觉标准溶液，日本INSENT公司；NaCl，国药集团化学试剂有限公司；QIAGEN DNeasy mericon Food Kit DNA基因组提取试剂盒，德国QIAGEN公司；MiSeq高通量测序配套试剂，美国Illumina公司；引物338F/806R，武汉天一辉远生物科技有限公司。

1.2 仪器与设备

SA 402B电子舌，日本INSENT公司；PEN3电子鼻，德国AIRSENSE公司；TGL-16M 冷冻离心机，上海卢湘仪离心机仪器有限公司；ND-2000C微量紫外分光光度计，美国Thermo公司；UVPCDS8000凝胶成像分析系统，美国ProteinSimple公司；Veriti FAST梯度PCR仪，美国ABI公司；Illumina MiSeq高通量测序平台，美国Illumina公司；R920型机架式服务器，美国DELL公司。

1.3 实验方法

1.3.1 样品采集

于2019年12月上旬从陕西省安康市镇坪县(E109°52′，N31°88′)和岚皋县(E108°9′，32°32′)的农户家中采集泡菜水14 份，编号为AK1～AK14，泡菜制作时间为2019年10月下旬—11月中旬，均使用老卤作为“引子”，原料均为红皮萝卜缨，少部分样品添加了韭菜和葱等辅料用于提味，泡菜水均为鲜亮的酒红色。样品采集时，首先使用长柄汤勺在泡菜坛中搅拌2 min，继而从上层舀取约200 mL泡菜水于500 mL样品瓶中。样品瓶置于含有冰袋的采样箱中低温运回实验室，途中每隔6 h左右拧开瓶盖排放样品产生的气体。

1.3.2 基于电子舌技术泡菜水滋味品质的评价

量取50 mL泡菜水和50 mL蒸馏水混合均匀后于8 000 r/min离心10 min，取上清液于电子舌测试杯中，参照文献[12]进行分析。

1.3.3 基于电子鼻技术泡菜水风味品质的评价

量取15 mL泡菜水于8 000 r/min离心10 min，取上清液于配套样品瓶中，样品瓶置于60 ℃的水浴锅中保温30 min，并于室温平衡10 min后上机测试。参照倪慧等[13]对泡萝卜水的测试参数进行分析，每份样本平行测试3 次，选取59、60和61 s时的响应值为测试值进行后续研究。

1.3.4 微生物宏基因组DNA提取和扩增

吸取20 mL泡菜水，于400 r/min离心10 min，取上清液，于8 000 r/min离心10 min取菌泥，使用基因组提取试剂盒进行DNA提取，参照折米娜等[14]方法对细菌16S rRNA V3～V4区进行扩增，扩增后的产物送至上海美吉生物医药科技有限公司进行测序。

1.3.5 生物信息学分析

使用QIIME(v1.70)平台对质控后的测序数据进行分类操作分类单元(operational taxonomic units, OTU)划分、分类学地位注释、α多样性分析和β多样性分析[15]，主要流程参照YANG等[16]对干酪中细菌多样性的研究。所有测序数据均已提交至MG-RAST数据库，登录号为mgp93 238。

1.3.6 多元统计学分析

采用皮尔森相关性分析对平均相对含量>1.0%的细菌属和品质指标之间的相关性进行研究；选取相关系数>0.4或<-0.4，且校正后P<0.05的品质指标，采用Cytoscape软件(v3.5.1)进行相关性网络图绘制；使用Procrustes分析对泡菜水菌群和品质进行共变化分析。其他绘图使用R软件和Origin 2019b软件完成。

2 结果与分析

2.1 泡菜水滋味和风味品质的评价

泡菜水各滋味指标相对强度的箱型图如图1所示。

图1 泡菜水滋味指标相对强度值的箱形图(n=14)Fig.1 Relative intensity of taste indexes in Paocai brine display by box chart注:后味A，涩的回味；后味B，苦的回味;丰度，鲜的回味

由图1可知，泡菜水的滋味品质之间存在较大的差异，酸味、涩味、咸味、鲜味、后味A和丰度的极差值均>1，其中酸味的组内差异最大。基于电子鼻技术，泡菜水风味指标强度表如表1所示。

表1 泡菜水风味指标强度表(n=14)Table 1 Relative intensity of flavor indexes in Paocai water

由表1可知，所有泡菜水的各风味指标之间均存在着较大的差异，响应值差异较大的传感器分别为W1C、W5S和W2S，差异系数分别为40.55%、40.47%和35.65%。由此说明，不同样品挥发性风味物质的差异主要在芳香类物质、氮氧化物和乙醇上。

2.2 泡菜水物种构成及多样性分析

进一步采用高通量测序技术对泡菜水中细菌构成和功能进行解析，发现泡菜水中细菌隶属于23 个门，其中优势细菌门(平均相对含量>1.0%)相对含量的比较分析如图2所示。

图2 基于门水平泡菜水细菌类群的比较分析Fig.2 Comparative analysis of bacterial structure in paocai brine at the phylum level

由图2可知，Firmicutes(硬壁菌门)、Proteobacteria(变形菌门)和Actinobacteria(放线菌门)为3 个优势细菌门，其平均相对含量分别为90.19%、7.95%和1.01%，大部分泡菜水中变形菌门和放线菌门的相对含量极低，仅AK11和AK14中存在较多的变形菌门。泡菜水中优势细菌属(相对含量>1.0%)相对含量比较分析如图3所示。

图3 基于属水平泡菜水细菌类群的比较分析Fig.3 Comparative analysis of bacterial structure in Paocai brine at the genus level

由图3可知，泡菜水中共发现284 个细菌属，Pediococcus(片球菌属)、Lactobacillus(乳杆菌属)和Pseudomonas(假单胞菌属)为优势菌属，平均相对含量分别为55.53%、29.83%和4.27%。AK1、AK2、AK7、AK8、AK9、AK12和AK13均以Pediococcus为主；AK3、AK4、和AK10均以Lactobacillus为主；AK5、AK6和AK11以Pediococcus和Lactobacillus为主，其比例接近1∶1；而AK14则以Pediococcus和Pediococcus为主，其比例亦接近1∶1。由此可见，虽然不同样品间优势菌群的类群相同，但其含量存在明显差异。

2.3 菌群与泡菜水品质关联性分析

为了探究菌群对于泡菜水品质的影响，本研究采用Procrustes分析方法，对泡菜水中菌群和品质之间的共变化趋势进行了分析，结果如图4所示。

图4 基于Procrustes分析菌群结构和品质的共变化趋势Fig.4 Covariant trend of microbial structure and quality of Paocai brine based on procrustes analysis

由图4可知，基于菌群结构和品质结构的同一泡菜水样品在空间排布上呈现一定的相似性，经Procrustes转换和显著性检验发现其相关性非常显著(P=0.001)。由此说明，泡菜水中的菌群群系对泡菜水的品质形成具有显著的影响。为进一步探究菌群对泡菜水品质的影响，本研究对优势菌属与泡菜水品质之间的相关性进行了计算，结果如图5所示。

图5 泡菜水优势细菌属和品质指标相关性的网络图Fig.5 Network diagram of the correlations among dominant bacterial genera and sensory indicators in Paocai brine注：实线表示正相关，虚线表示负相关；线的粗细表述相关性的大小

由图5可知，乳杆菌属与3 个对芳香型化合物敏感的传感器响应值均呈显著正相关(P<0.05)，而与对有机硫化物、氮氧化物和乙醇等化合物敏感的传感器响应值呈显著负相关(P<0.05)，片球菌属则呈现相反趋势；假单胞菌属仅与酸味指标呈显著负相关(P<0.05)。由此可见，乳酸杆菌的群系构成对泡菜品质的形成具有重要作用。

3 结论与讨论

本研究采用MiSeq高通量测序技术发现Firmicutes为安康地区泡菜水中的优势细菌门，与以往研究结论相同[17]。亦发现Pediococcus、Lactobacillus和Pseudomonas为优势细菌属，累计平均相对含量高达近90%。前期针对不同地区微生物优势群系研究的报道与本研究存在一定的差异，JEONG等[18]和KIM等[19]研究表明，Lactobacillus、Weissella(明串珠菌属)和Leuconostoc(肠球菌属)为韩国泡菜(Kimchi)中的优势菌属；CAO等[20]研究表明Lactobacillus和Pediococcus在四川地区泡菜中占主导地位，ZHAO等[21]对四川地区泡菜研究表明除Lactobacillus和Pediococcus外，还存在Leuconotoc和Lactococcus(乳球菌属)；李欣蔚等[22]对东北地区泡菜研究表明Lactobacillus、Pediococcus和Pseudomonas为其优势菌属，同时存在Wohlfahrtiimonas(污蝇解壳杆菌属)细菌。造成差异的原因可能在于泡菜中的微生物群系受制作地环境、制作工艺、原料、温度、盐浓度和酸度等诸多因素的影响[23]。

各地在制作泡菜时均偏爱使用老卤作为“引子”，长时间循环使用的老卤可以赋予泡菜更好的感官品质，原因在于老卤中含有较高含量的乳酸菌菌群，循环使用时间越长卤水中细菌多样性越低，但耐酸的Lactobacillus含量反而越高[20]。本研究采用Procrustes分析发现泡菜水中的菌群群系与泡菜水品质具有共变化趋势，同时相关性分析结果表明,Lactobacillus与泡菜水中芳香性挥发物质含量呈正相关。由此可见，Lactobacillus对安康地区泡菜水品质的形成和提升具有积极的作用。

本研究推断安康地区泡菜水中可能存在较为独特的细菌乃至乳酸菌类群，在对安康地区泡菜水中乳酸菌资源进行收集、鉴定和保藏的基础上，采用全基因组测序对具有优良发酵特性乳酸菌菌株的功能特征和发酵特性进行解析[24]，无论是对泡菜微生物群系和遗传多样性等理论研究，还是对泡菜品质的提升均具有积极意义。在后续研究中从四川省、重庆市及东北地区采集更多的泡菜水样品，使用MiSeq测序技术实现多地区来源样品细菌类群的全面、平行分析，进而实现不同产地样品中核心细菌类群的甄别，对安康地区泡菜水中可能存在较为独特的细菌乃至乳酸菌类群这一推论的验证具有积极意义。不可否认，由于MiSeq测序技术仅针对细菌16S rRNA的某一个或几个区域进行测序，故在解析微生物群落结构时为保证结果的可靠性，一般仅在分类学地位“属水平”上展开分析讨论，且更关注相对含量>1.0%的微生物类群[25]，加之纳入本研究的样品仅采集自安康地区，因而使得本研究存在一定的局限性。后续研究中采用在测序读长方面具有天然优势的PacBio SMRT测序技术或使用宏基因组学测序手段在分类学地位“种水平”进一步对泡菜水中细菌类群进行解析亦极为必要。