G2/M细胞周期阻滞在急性肾损伤向慢性肾脏病转变中的作用研究进展

刘水英 尹建永 张芳菲 芦泽源 王锋

200233 上海，江苏大学附属上海市第八人民医院肾内科(刘水英，王锋)；200233 上海交通大学附属第六人民医院肾内科(尹建永，张芳菲，芦泽源，王锋)

急性肾损伤(acute kidney injury，AKI)是一种广泛存在的临床综合征，其病死率仍居高不下，尤其是在重症监护病房(>50%)[1-2]，并且至今缺乏有效的治疗干预措施。AKI长期以来被认为是一个可逆的过程，然而，在过去的数十年里，从动物模型和人类流行病学研究中得到的不断发展的证据表明，很多AKI患者的肾功能并不能完全恢复，反而会在急性期后出现慢性化转归，逐步进展成慢性肾脏病(chronic kidney disease，CKD)甚至终末期肾病(end-stage renal disease，ESRD)[3]。最近一项荟萃分析证实，与正常人相比，AKI患者进展为CKD的风险增加8.8倍，进展为ESRD的风险增加3.3倍；长期随访中约1/3以上的AKI患者进展至CKD或ESRD[4]。CKD在世界范围内越来越普遍，除了增加患者的病死率之外，还对个人的生理和心理产生了强烈的负面影响。最近二十年来，CKD的发病率增加了三倍多；此外，根据世界卫生组织报道，到2020年，它将成为全球死亡和残疾的三大常见原因之一[5]。AKI已成为CKD及ESRD发生的独立危险因素，日益受到重视。因此，探究AKI向CKD进展中的关键致病分子机制，从而进行针对性的干预已成为亟待解决的临床问题。

一、肾小管上皮细胞异常修复

目前参与AKI后肾单位功能恢复的病理生理过程尚不完全清楚。在损伤后，肾小管细胞尤其是近端肾小管上皮细胞会失去极性及刷状缘,膜蛋白比如β-整合素、Na+/K+-ATP酶错位，如果损伤持续存在会导致小管细胞死亡[6]。在AKI后的正常修复过程当中，存活的小管细胞先去分化，然后沿基底膜迁移、增殖，最后分化，恢复还原成有功能的肾单位[7-9]。然而，在许多情况下，严重的AKI或AKI后存在肾功能受损，将诱导促纤维化信号，导致修复不良和CKD。近年来，对AKI的修复不良的发生机制提出了许多不同的理论和机制。上皮-间质转化(epithelial-mesenchymal transition，EMT)假说认为肾小管细胞损伤后发生表型转化，表现为上皮标志物的丢失和间充质特征的获得。然而，最近的一些包括使用遗传细胞谱系追踪的研究，未能发现分化转移的证据，因此对这一概念提出了质疑[5，10-11]。但是，有研究发现小管上皮细胞经历部分EMT，在疾病的发展过程中，细胞表达上皮细胞和间充质细胞的标志物，并与基底膜保持联系。Lovisa等[12]进一步证明，该部分EMT足以通过在G2期细胞周期停滞，诱导小管功能受损，导致小管上皮细胞异常恢复，进而发展为肾纤维化。

二、细胞周期阻滞

1.肾脏细胞周期生理、病理生理学 细胞周期由4个具有特定特征的不同阶段组成(G0～G1、S、G2和M期)。其中G2期是细胞有丝分裂(M期)前细胞快速生长和蛋白质合成的阶段。在M期，细胞生长停止，并有序的进展到细胞分裂。细胞周期的进展被周期蛋白(cyclins)、周期蛋白依赖性激酶(cyclin-dependent kinase，CDK)及其抑制剂(如p15、p16INK4a、p21和p27)精细控制[11]。CDK与cyclins形成复合物，导致CDK的激活和下游靶点的丝氨酸/苏氨酸磷酸化，从而促进细胞周期的进展[11]。为了确保细胞周期过程的保真度，在细胞分裂期间存在许多称为检查点的质量控制步骤[11]。G2/M检查点是细胞有丝分裂过程中一个重要的检查点，常被DNA损伤激活。

正常生理条件下，小管上皮细胞分裂率极低。然而，在AKI后，细胞分裂率急剧增加，以取代坏死/凋亡细胞。这在近端小管的S3段尤其普遍[6]。轻度损伤后，存活的小管细胞增殖，覆盖暴露的基底膜，恢复细胞数量[11]。结合增殖，这些细胞也会短暂地去分化，表达胚胎学标记物，然后再分化成特殊的小管细胞，导致肾单位的修复[9]。当新生的小管生长受阻、无法分化并萎缩时，这些小管表现出病理信号、旁分泌和自分泌活性，干扰肾间质和肾间质细胞之间的正常相互作用，导致异常修复和纤维化[13]。

2.G2/M期阻滞是AKI向CKD转化的重要发病机制 一系列研究表明，肾小管上皮细胞中的G2/M期阻滞是导致AKI后异常修复和肾纤维化的重要驱动因素[14-16]。虽然肾小管上皮细胞不会转分化为肌成纤维细胞，但受损的近端上皮细胞可以通过旁分泌机制在纤维化过程中发挥重要作用，其特征是G2/M期停滞和促进原纤维因子的产生。Yang等[14]证实G2/M期阻滞参与肾损伤后的纤维化,通过对肾损伤后肾小管上皮细胞周期行为的观察，他们发现在G2/M期上皮细胞周期停滞与损伤后修复不良引起的肾纤维化之间存在因果关系;他们在缺血、药物及梗阻所致AKI模型中发现，损伤后的小管细胞很多阻滞于G2/M期，无法去分化，呈现促纤维化的表型，能够产生和分泌多种促纤维化因子，如转化生长因子-β1(transforming growth factor-β1，TGF-β1)和结缔组织生长因子(connective tissue growth factor，CTGF)，进而促进肾脏纤维化进展。此外，近端小管上皮细胞阻滞于G2/M期可激活c-Jun氨基末端激酶(c-Jun NH2-terminal kinase，JNK)信号通路，上调促纤维化细胞因子的产生。这就建立了一个促纤维化的微环境，通过该微环境，成纤维细胞被永久激活[17]，表现为持续增殖和细胞外基质的沉积[6，18-19]。并且通过药理学干预，增加损伤后G2/M期阻滞细胞数量可使纤维化结局恶化，而促进G2/M期活动的干预可减少纤维化[11，15-16]。以G2/M检查点为靶点，在损伤阶段维持细胞周期的正常进展，有望成为阻止CKD进展的一个有吸引力的治疗靶点[11]。Cianciolo等[15]报道组蛋白乙酰酶抑制剂可减少G2/M期阻滞细胞数量，减少损伤后小管萎缩和间质纤维化。有研究表明Twist(编码Twist家族bHLH转录因子1)和Snail 1(编码Snail家族锌指蛋白1)转基因的表达，可促进持续的TGF-β1诱导的肾小管上皮细胞的G2期阻滞，用TGF-β1体外诱导EMT也会诱导肾小管上皮细胞产生G2/M期阻滞，限制细胞的再生和修复潜能；通过敲除Twist和Snail 1基因抑制EMT，导致G2/M期抑制的小管上皮细胞数量显著减少，可减少肾实质和间质性纤维化[20-21]。

3.参与AKI后G2/M期阻滞调控的相关因子 然而，G2/M期阻滞细胞分泌促纤维化因子的确切细胞机制尚不清楚。近年来，许多学者对肾小管上皮细胞G2/M期调控进行了研究，为肾脏纤维化进展开辟了新的治疗途径。

(1)毛细血管共济失调突变基因/Rad3相关蛋白激酶通路：DNA损伤导致毛细血管共济失调突变基因/Rad3相关蛋白激酶(Ataxia Telangiectasia Mutated/Ataxia Telangiectasia and Rad3-related protein，ATM/ATR)通路活化，细胞周期检查点激酶(checkpoint kinase 2，CHK2)活化后磷酸化抑癌基因p53和磷酸酶cdc25，抑制Cdc2导致G2/M阻滞[22-25]。在正常情况下，这种阻滞确保了DNA在继续有丝分裂前的修复时间，研究中发现这种突变的细胞更易受到DNA损伤和基因组不稳定的影响，并经历G2/M期停滞。这导致范可尼贫血相关核酸酶1突变的患者发生肾小管萎缩和纤维化[26]。Romanov等[27]发现低剂量的马兜铃酸通过激活DNA损伤检查点通路ATM-CHK2-p53-p21，引起活性氧产量的增加，可导致p53依赖的p21积累，在G2/M期诱导细胞周期阻滞。p21是Nishioka等[28]最早探索的蛋白之一，这种蛋白似乎在AKI和CKD进展过程中发挥不同的作用。p21在AKI期间似乎具有保护作用，这是通过p21-/-小鼠有更明显的肾功能障碍和死亡率来评估的，而在5/6肾切除术后CKD的进展过程中，p21-/-小鼠的组织病理学损伤较少。p53是p21转录的调节因子，在AKI后也会上调，其抑制或基因缺失可减少肾脏损害[29]。Liu等[30]在细胞培养(人和大鼠肾小管上皮细胞)和小鼠单侧输尿管梗阻模型中发现了一个缺氧激活的p53反应的促纤维化通路，在缺氧时，由缺氧诱导因子诱导的p53上调抑制细胞周期进展，导致G2/M期细胞的积累，并激活促纤维化因子TGF-β和CTGF介导的信号通路，导致细胞外基质产生和肾纤维化。

(2)p38-丝裂原活化蛋白激酶通路和Wee1激酶：不同应激刺激(如缺氧)也可通过p38-丝裂原活化蛋白激酶(p38-mitogen-activated protein kinase，p38-MAPK)通路诱导G2/M期阻滞。MAPK可以磷酸化cdc25，导致其泛素化。因此，cdc25不再能够激活Cdc2/cyclin A复合物，从而抑制G2期到M期的转变[31]。Borst等[32]报道的另一项重要发现表明，MAPK信号通路的重要中介物JNK，即使在严重缺血损伤后数周，在近端小管上皮细胞中仍被激活。这种持续的激活是由于G2/M期细胞被抑制，导致促纤维化细胞因子的上调。马兜铃酸处理的细胞中产生大量活性氧，3个主要的MAPKs中，ERK1/2和p38被激活，而JNK未被激活；通过药物抑制ERK1/2和p38以及N-乙酰-L-半胱氨酸抑制活性氧生成，可以减少部分G2/M检查点细胞，减轻肾脏纤维化，肾小管上皮细胞凋亡水平下降[27]。Chen等[33]发现人Wharton's Jelly间质基质细胞来源的微泡(microvesicles，MVs)可以通过ERK1/2信号传导减轻G2/M期阻滞，从而缓解缺血再灌注损伤大鼠的肾脏纤维化。

G2/M阻滞的第三个重要介质是Wee1激酶。Wee1是一种酪氨酸激酶，它通过磷酸化Cdc2的酪氨酸残基使Cdc2处于非活性状态[34]。Cdc2的再活化是通过cdc25去磷酸化实现的[35]。

(3)其他机制(如自噬、microRNA)：Liu等[36]首次发现缺氧时，miR-493在近端小管上皮细胞中高表达，而降低了细胞周期调节因子STMN-1的表达，增加了G2/M期细胞和促纤维化因子在近端小管上皮细胞中的比例，这些作用可以通过miR-493抑制剂在体外逆转，表明miR-493-STMN-1通路参与了缺氧诱导的肾小管上皮细胞G2/M期阻滞和肾纤维化。

Li等[37]发现西罗莫司增强自噬可以抑制胶原蛋白1的积累和肾纤维化；而通过近端小管上皮细胞特异性缺失自噬相关基因5(autophagy-related gene 5，ATG5)消融自噬，细胞周期在G2/M期明显停止，间质纤维化严重，ATG5表达增强，可拯救G2/M期阻滞，表明ATG5介导的近端上皮细胞自噬是一种关键的宿主防御机制，通过阻断G2/M阻滞来预防肾纤维化。Canaud等[38]进一步证实了近端肾小管细胞在G2/M期成为西罗莫司自噬空间偶联区(TOR-autophagy spatial coupling compartments，TASCCs)的靶点，从而促进了类似于衰老相关分泌表型的促纤维化分泌；细胞周期蛋白G1可促进肾小管上皮细胞中G2/M期阻滞和TASCC的形成，细胞周期蛋白G1的缺失减少了体内G2/M期细胞和TASCC的形成；特异性敲除小管上皮细胞中TASCC关键成分可降低CKD小鼠的肾纤维化进展速度。

综上所述，我们对近年来AKI向CKD转化的认识进展强调了肾小管上皮G2/M期阻滞在异常修复过程中的重要作用，其中对G2/M期阻滞调控相关因子的研究，为设计有针对性的治疗策略以促进适应性肾脏修复和减少AKJ后的进展为肾纤维化和CKD提供了重要的机会。