对比剂急性肾损伤动物模型的研究进展

王豆豆 胡杰 袁萌 高婷婷 董红霖

030000 太原，山西医科大学第二医院血管外科

对比剂急性肾损伤(contrast-induced acute kidney injury，CI-AKI)根据2018年欧洲泌尿生殖放射学会(ESUR)CI-AKI防治指南定义为：使用碘对比剂后48～72 h内发生的血肌酐(serum creatinine，Scr)升高超过0.3 mg/dL(26 μmol/L)，或大于基线值的1.5～1.9倍[1-2]，其病理改变基础是肾髓质缺血缺氧、肾小管上皮细胞直接损伤以及肾小管阻塞[3]。病理生理变化为急性肾损伤(acute kidney injury,AKI)的代谢终产物及内源性有害物质保留在体内，导致水电解质及酸碱平衡紊乱和内分泌功能障碍，最终可出现心肾综合征(cardiorenal syndrome，CRS)，是指对于心脏或肾脏来说，各种原因导致两个器官出现的急慢性脏器功能不全，可互为影响，互为因果[4]。临床上多表现为非少尿型AKI，易漏诊，其发生与晚期心血管事件、死亡风险增加有关[5]。CI-AKI已成为院内获得性AKI的第三大病因，发病率仅次于肾灌注不足和肾毒性药物所致AKI，其发病率急剧上升，尤其在高龄、糖尿病、高血压等高危患者中的发病率达40%，其中约11%发展为慢性肾脏病、终末期肾病。本文通过总结几种CI-AKI动物模型的制备方法，为进一步研究CI-AKI提供新视角。

一、吲哚美辛及N-硝基-L-精氨酸甲酯联合应用诱导CI-AKI模型

1.病理损伤机制 研究发现，在正常小鼠腹腔注射碘克沙醇对比剂，肾功能、Scr水平未见明显改变；而在已存在肾损伤的基础条件下注射碘克沙醇对比剂，Scr水平则显著升高，可达到CI-AKI诊断标准，表明在已存在基础肾损伤的情况下应用对比剂较正常条件下更容易发生AKI[6]。

吲哚美辛为非甾体抗炎药，是环氧化酶(cyclooxygenase，COX)的抑制剂，而COX是机体产生前列腺素的限速酶，吲哚美辛通过抑制前列腺素的产生从而发挥镇痛、抗炎、解热作用。在肾脏中，COX-1和COX-2这两种酶的亚型都参与维持肾灌注，故吲哚美辛可导致肾灌注减少，从而导致功能障碍。实验结果显示：吲哚美辛可导致肾脏中激活的一氧化氮合酶(nitric oxide synthase，NOS)活性二聚体水平降低，从而导致肾脏一氧化氮(NO)合成减少，表现为肾脏亚硝酸盐水平降低，肾灌注减少，继而肾小球和肾小管损伤[7]。长期使用非甾体抗炎药可作用于血管内皮细胞，影响血管的生成，亦可通过抑制促血管生成因子如血管内皮生长因子等的表达而阻断血管的生成[8]。

N-硝基-L-精氨酸甲酯为NOS抑制剂。Godo等[9]在文章中描述NO是由细胞内左旋精氨酸(L-arginine，L-Arg)经NOS作用合成，在生理状态下，L-Arg作为前体物质在细胞内固有型NOS的作用下，经氧化、脱氢、裂解、水解等反应，最终生成NO和L-瓜氨酸。NO具有许多良性心血管生理效应，如舒张血管、调节局部血流、抑制血管平滑肌细胞增殖、抑制血小板黏附聚集、防止血栓形成等。NOS抑制剂与NO合成底物L-Arg竞争NOS，使NO合成减少，从而造成肾功能不全。

2.模型构建 Jeong等[6]在研究氧化应激在CI-AKI发病中的作用中选用雄性C57BL/6J小鼠，隔夜脱水16 h后，间隔15 min依次腹腔注射吲哚美辛(10 mg/kg，溶于乙醇)、N-硝基-L-精氨酸甲酯(10 mg/kg，溶于0.9%生理盐水)、碘海醇(4 000 mg碘/kg)，24 h后安乐死，收集血清尿素氮并摘除肾脏。Yue等[10]在CI-AKI药物筛选实验中使用8～10周龄SD大鼠，在禁水12 h后，腹腔注射10%水合氯醛(0.32 mL/100 g)麻醉，小鼠左股静脉插管固定，间隔15 min依次注射吲哚美辛(10 mg/kg)，N-硝基-L-精氨酸甲酯(10 mg/kg)、76%泛影葡胺(10 mL/kg)，泛影葡胺注射时间不少于5 min，对比剂注射24～48 h后，收集大鼠尾静脉血检测Scr水平，结果显示Scr水平较注射前相对升高25%，符合CI-AKI诊断标准(2003年ESUR指南标准)，提示造模成功。

二、脱水加呋塞米注射诱导CI-AKI模型

1.病理损伤机制 研究发现，脱水患者发生AKI的风险增加[11]。呋塞米是一种常用的利尿剂，可抑制髓袢升支上皮细胞管腔内侧的Na-K-Cl转运体导致尿钠排泄和利尿[12]。临床研究发现，在充分水化的基础上给予小剂量呋塞米可以预防CI-AKI，水化可保证患者有充足的血容量，不仅能改善肾脏缺血，还能加速对比剂排泄，减轻对比剂对肾小管的毒性。呋塞米可直接扩张肾血管，降低肾血管阻力，并增加肾血管血流量，尤其是肾皮质深部血流量，且由于其袢利尿作用可预防过度水化引起的水肿。但是血容量不足的患者应用利尿剂，可能导致肾前性缺血，加重肾髓质的缺血、缺氧[13]。持续输注呋塞米并不能降低AKI发生率或有AKI风险患者的病死率[14]。

2.模型构建 Sun等[15]在实验中使用250～300 g大鼠，脱水3 d后肌内注射呋塞米(10 mL/kg)，20 min后尾静脉注射对比剂碘海醇(350 mg碘/mL，10 mL/kg)，结果显示：Scr水平较基础值升高了42.9%，符合对比剂肾病诊断标准；Cheng等[16]在研究中使用250～300 g大鼠，脱水48 h后肌内注射呋塞米(10 mL/kg)，30 min后尾静脉注射对比剂碘海醇(350 mg碘/mL，15 mL/kg)，结果显示：在对比剂应用24 h后Scr水平较基础值升高50%，达到了CI-AKI的诊断标准。

三、肾切除术加脱水诱导CI-AKI模型

1.病理损伤机制 5/6肾切除后的大鼠肾功能不全以及高血压导致大鼠对CI-AKI的易感性增加，但是单一干预不能产生可靠的模型，因此对大鼠进行额外损伤预处理是建立CI-AKI大鼠的关键，通过实验发现大鼠术后6周肾功能稳定，既往预处理多采用肾毒性药物及缺血损伤，但是会影响研究结果，而脱水48 h几乎不会影响大鼠的血容量，脱水48 h后未注射对比剂前大鼠的Scr、血尿素氮以及尿肌酐水平没有变化[17]。

2.模型构建 Liu等[17]在研究中使用180～200 g大鼠，腹腔注射4%戊巴比妥钠(40 mg/kg)麻醉后行右肾切除+左肾2/3切除术，术后6周脱水48 h，尾静脉注射对比剂碘克沙醇(10 mL/kg)，结果显示：对比剂应用24 h后Scr水平较基线水平增加25%，达到了CI-AKI的诊断标准。

四、应用糖尿病小鼠诱导CI-AKI模型

1.病理损伤机制 CI-AKI在糖尿病、慢性肾脏病人群中发生率超过50%，其病死率高达34%[18]。CI-AKI的危险因素包括急性肾功能不全、糖尿病、高龄、肾毒性药物、充血性心力衰竭及血流不稳定等，而糖尿病被认为是CI-AKI的独立危险预测因子，发生CI-AKI的概率是5.7%～29.4%[19]。

2.模型构建 王明秋等[18]在研究中使用250～300 g雄性SD大鼠，适应性饲养1周，禁食12 h后给予腹腔一次性注射链脲佐菌素(STZ，60 mg/kg)，72 h后尾静脉采血，血糖仪测定血糖，血糖≥16.7 mmol/L、空腹胰岛素水平不低于正常范围最低值表示2型糖尿病大鼠模型造模成功，将造模成功的大鼠纳入实验组，给予尾静脉注射碘普罗胺(12 mL/kg)，构建CI-AKI模型，实验结果显示：糖尿病CI-AKI大鼠Scr水平在48～72 h时升高大于25%，且其肾组织病理改变有肾小管管腔扩张变形、空泡形成及部分肾小管上皮细胞坏死性改变，提示糖尿病CI-AKI模型成功建立。陈军[20]在研究中使用180～200 g雄性SD大鼠，适应性饲养1周后，禁食24 h，腹腔注射2%的STZ(60 mg/kg，3 mL/kg)，3 d后测定随机血糖，若血糖≥16.7 mmol/L提示造模成功，继续饲养第10周末，留取24 h尿液后，连续2 d，分别经双侧股静脉每天注入76%的复方泛影葡胺(10 mL/kg，10 min内缓慢打入)，脱水24 h后处死大鼠，进行指标检测，结果显示：造模后Scr显著升高，达到CI-AKI诊断标准。

五、总结

综上所述，在以上几种CI-AKI模型中，每种造模方法各有其优缺点(表1)。吲哚美辛及N-硝基-L-精氨酸甲酯联合应用加对比剂造模所用时间比较短，花费相对比较少，但是由于对大鼠肾损伤较重，创伤较大，大鼠死亡率稍高，且模型中所用的泛影葡胺非临床上常用的对比剂，但众多研究仍采用此对比剂进行实验研究，因此本研究仍可反映CI-AKI的基本过程，新型CI-AKI的研究有待进一步进行，且由于应用血管损伤药物，对于研究对比剂肾病的发生机制有一定局限性。

应用5/6肾切除术+脱水+对比剂造模，广泛地用于研究慢性肾脏病，由于肾脏组织大部分被切除，死亡率较高，操作复杂，成模率低，且对于应用肾脏组织进行后续实验研究的影响较大，因此限制了其在实验研究中的应用。

应用糖尿病大鼠加对比剂进行造模，由于在临床上患有糖尿病的患者日渐增多，进展到糖尿病肾病的患者也在增多，因此在糖尿病肾病基础上建立CI-AKI模型更符合临床实际情况，且对大鼠创伤较小、死亡率较低、模型组成模率高、肾损伤较轻，然而肾损伤较轻可能和糖尿病肾病造模时间相对较短，未发展到肾衰竭的终末阶段有关，大鼠在发生糖尿病10周后虽然肾功能出现损伤，此时按照病程考虑此时大鼠处于糖尿病肾病的代偿阶段，肾脏处于高代谢状态，因此延长糖尿病造模时间可能会增加CI-AKI的程度。此外，单次腹腔大剂量注射STZ建立的糖尿病更接近于1型糖尿病，这和临床上糖尿病以2型糖尿病患者居多的情况仍存在差异，且由于糖尿病会对血管、神经造成一定影响，会影响实验研究。

表1 对比剂急性肾损伤各造模方法的比较

脱水+呋塞米注射+对比剂造模，操作步骤简单，不需要进行复杂的手术操作，容易复制，且脱水48 h不影响老鼠的血容量致低灌注以及对Scr没有影响，不会导致肾功能恶化。由于对比剂是通过尾静脉注射的，黏稠度较高，如果注射速度过快或者因尾静脉穿刺失败注射到皮下组织，24 h后鼠尾会因缺血而坏死，因此应熟练操作以及接受相关专业培训。脱水加呋塞米注射由于对肾脏血管损伤作用较小，可用于CI-AKI发病机制的研究。研究者可根据自己的研究目标选择最适合的动物模型，并且将各种模型的优缺点考虑在内，将不会影响模型的使用。

随着实验动物科学的不断发展，各种CI-AKI动物模型的制备从实验动物的选择到实验方法、实验手段等将会日臻完善，从而为人类更深刻地认识CI-AKI的发病机制和病理生理过程以及预防和研究新的治疗药物提供重要的实验手段。