三七地上茎4个转录因子基因转录水平的纵向变化及其与总三萜皂苷含量的关系

臧灵飞，张洪玲，杨 迪，2，赵鹏宇，赵昶灵*，李桂琼，古朝山，张 优，顾 凡，陈杞临

(1.云南农业大学 农学与生物技术学院，云南 昆明 650201； 2.云南省热带作物科学研究所，云南 景洪 666100； 3.上海理工大学 环境与建筑学院，上海 200093)

转录因子基因(transcription factor gene, TF)是高等植物三萜皂苷生物合成的调节基因之一，但高等植物三萜皂苷合成相关的转录因子(transcription factor, TF)迄今不完全清楚；三七〔Panaxnotoginseng(Burk.) F. H. Chen〕的所有器官均能合成三七最关键的药理活性成分三萜皂苷，目前初步认为，参与三七三萜皂苷合成的转录因子主要包括碱性螺旋-环-螺旋蛋白(basic helix-loop-helix, bHLH)、乙烯响应因子(ethylene response factor, ERF)、v-myb骨髓母细胞增多症病毒癌基因同源物(v-myb myeloblastosis viral oncogene homolog, MYB)和WRKY蛋白(WRKY protein)[1-5]。这4种转录因子DNA结合结构域的组成不同。bHLH的DNA结合结构域位于N端的第145～190个氨基酸残基间[6]；ERF的位于第75～134个氨基酸残基间[7]；MYB的N端由1～3个串联的、不完全重复的R结构(即：R1、R2和R3)组成，R结构中的氨基酸残基以螺旋-转角-螺旋(helix-turn-helix, HTH)的形式参与结合DNA，DNA结合结构域位于第7～66个氨基酸残基间[8]；WRKY蛋白含高度保守的、位于第188～244个氨基酸残基间的WRKY结构域，该结构域的核心序列是靠近N端的、具DNA结合活性的7个保守氨基酸残基(即：WRKYGQK)[9]。

一年生三七植株的绿紫(过渡地上)茎因花色苷在茎上部的局部积累而表现出黄金分割式紫化[10]；研究表明，三七地上茎的三萜皂苷主要是人参皂苷Rb1[11-12]，而在三七绿紫茎中，总花色苷含量与总三萜皂苷含量(total triterpenoid saponin content, TTSC)之间呈极显著负相关[12]。但是，关于bHLH、ERF、MYB和WRKY对三七绿紫茎三萜皂苷合成的差异性调控贡献鲜见报道。因此，对三七绿紫茎中三七碱性螺旋-环-螺旋蛋白基因(basic helix-loop-helix gene,bHLH)、乙烯响应因子基因(ethylene response factor gene,ERF)、v-myb骨髓母细胞增多症病毒癌基因同源物基因(v-myb myeloblastosis viral oncogene homolog gene,MYB)和WRKY1蛋白基因(WRKY protein gene,WRKY1)转录水平的纵向变化及其与TTSC间的相关性进行研究，旨在探明这4种转录因子基因(transcription factor gene, TF)对绿紫茎三萜皂苷合成的差异性贡献，以揭示绿紫茎中三萜皂苷合成相关的主要转录因子，为三七绿紫茎三萜皂苷合成转录调控机理的研究提供参考。

1 材料与方法

1.1 材料

试材：一年生三七绿紫茎植株(平均株高约18 cm)于2017年和2018年12月随机采集于云南省文山州砚山县盘龙乡的苗乡三七科技有限公司(23°31′48″N，104°19′21″E，海拔1 540 m)。三七为垄作，垄宽150 cm、高30 cm，垄沟宽30 cm；棚顶和棚四周覆2层黑色聚乙烯遮阳网[13]；植株的采集与预处理按文献[13-14]进行，2017年和2018年分别采集80株，将茎均分为18段，将相应茎段混合、加液氮研磨成粉，于-80℃保存备用。

试剂：乙醇，购自天津市风船化学试剂科技有限公司；冰醋酸，购自天津市富宇精细化工有限公司；香草醛，购自天津市光复精细化工研究所；高氯酸，购自江苏强盛功能化学股份有限公司；EASYspin Plus Plant RNA Kit，购自北京艾德莱生物科技有限公司；TransScript®All-in-One First-Strand cDNA Synthesis SuperMix for qPCR (One-Step gDNA Removal)和TransScript®Top Green qPCR Supermix，购自北京全式金生物技术有限公司；SanPerp柱式DNA胶回收试剂盒，购自生工生物工程(上海)股份有限公司。对照品，人参皂苷Rgl，购自上海源叶生物科技有限公司。

仪器：高速冷冻离心机(HC-3018R型，安徽中科中佳科学仪器有限公司)，紫外-可见分光光度计〔Agilent Cary 60型，为安捷伦科技(中国)有限公司产品〕，实时荧光定量PCR仪(7500型，美国应用生物系统公司)。

1.2 方法

1.2.1 三七绿紫茎茎段中bHLH、ERF、MYB和WRKY1转录水平的检测

1) 茎段总RNA的提取和cDNA一链的合成。用EASYspin Plus Plant RNA Kit提取茎段总RNA，检测RNA提取液的OD260和OD280，以评价RNA的纯度和得率，RNA的完整性则用1%的琼脂糖凝胶电泳检测；cDNA一链用TransScript®All-in-One First-Strand cDNA Synthesis SuperMix for qPCR (One-Step gDNA Removal)合成[14]。

2) 三七bHLH、ERF、MYB和WRKY1特征片段扩增引物的设计及其适合性评价。借助Primer 6.0，扩增三七bHLH、ERF、MYB和WRKY1特征片段的引物分别基于bHLH、ERF、MYB和WRKY的DNA结合结构域设计，依托的碱基序列分别为竹节参(Panaxjaponicas)bHLH1的全长(登录号：ALB38667.1)等、竹节参(P.japonicas)ERF1的全长(登录号：ALB38666.1)等、人参(Panaxginseng)MYB1的全长(登录号：APU53711.1)等以及三七(P.notoginseng)WRKY1(即：PnWRKY1)(登录号：AJG43747.1)的全长；此外，扩增内参基因三七甘油醛-3-磷酸脱氢酶基因(glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase gene, GAPDH)特征片段的引物来自文献[15](表1)。然后，以cDNA一链为模板，以设计的引物进行PCR扩增，扩增子用1%的琼脂糖电泳检测(电压120 V，电流130 mA，时间25 min)，同时进行胶回收后送昆明硕擎生物科技有限公司测序；据扩增子的大小和碱基序列与bHLH、MYB、ERF和WRKY的DNA结合结构域对应的碱基序列的相似程度来评价引物的合适性。

3) 茎段中bHLH、ERF、MYB和WRKY1转录水平的检测。茎段中三七bHLH、ERF、MYB和WRKY1的转录水平用实时荧光定量PCR(quantitative real-time PCR, qRT-PCR)检测，以cDNA一链为模板、以三七GAPDH为内参，据文献[14]，按试剂盒TransStart®Top Green qPCR Supermix的说明完成。

表1 三七bHLH、ERF、MYB、WRKY1和GAPDH特征片段扩增的引物

Table 1 Primers used to amplify the characteristic fragments of thebHLH,ERF,MYB,WRKY1 and GAPDH ofP.notoginseng

基因Gene引物(5′→3′)Primer正向引物反向引物退火温度/℃Annealing temperature扩增子大小/bpAmplicon sizebHLHGCTTCTCAAGGTGCTAAGAACAGATTCCGTGGACTTC58.2217ERFGTGGAGTACCTCTCGGAAGCAGTCCTCATTTGGGAA56.0200MYBATGAAGGAGCGACAGAGGAGCGTTCAAGGCAGGATT56.5126WRKY1ACAGTGGAGATTAGAAGAGTCGTATGTCAGACTAGCA58.0181GAPDHGTGTTCACTCTATCACTGCCACTCGCTTTCCCTCTGACTCCTCC55.0279

注：退火温度由PCR确定，扩增子大小由昆明硕擎生物科技有限公司预测.

Note:The annealing temperatures were determined by the PCRs and the amplicon sizes were predicted by Kunming Shuoqing Biotechnology Co.

1.2.2 三七绿紫茎茎段总三萜皂苷含量的检测 茎段的总三萜皂苷含量(TTSC)用“香草醛-高氯酸比色法”检测，参照文献[12]进行测定并略作修改，称茎段粉0.100 g；在60℃水浴加热15 min后放入冰水浴中2 min。试验重复2次。

1.3 数据分析

采用Excel 2010作图；SPSS 25.0进行方差分析和双因素相关性分析；用“百迈客云”的在线工具(https://international.biocloud.net/zh/software/ tools/heatmap/-1/-1)绘制转录水平的热图[16]。

2 结果与分析

2.1 三七绿紫茎茎段总RNA的质量特征

从图1看出，提取的三七绿紫茎茎段总RNA在1%琼脂糖凝胶电泳时显示28 S和18 SrRNA清晰条带，亮度基本均匀；RNA的得率为10.480～13.440 μg/g，OD260/OD280为1.805～2.151。

注：M为Marker，1～18为茎从顶部向基部被均分为18段。

Note: M，Marker；1～18 indicated that the stems were evenly divided into 18 segments from the tops to the bases.

图1三七绿紫茎茎段总RNA的1%琼脂糖凝胶电泳图谱

Fig.1 1% agarose gel electrophoretogram of the total RNAs extracted from the segments of the purplish-green stems ofP.notoginseng

2.2 三七bHLH、ERF、MYB和WRKY1特征片段扩增引物的适宜性

用于扩增三七bHLH、ERF、MYB、WRKY1和GAPDH特征片段的引物以cDNA一链为模板进行PCR时，扩增子分别为217 bp、200 bp、126 bp、181 bp和279 bp，均与理论预测值相符；在1%琼脂糖电泳图上，所有扩增子均表现为清晰的单一条带(图2)；4种扩增子的碱基序列分别与设计引物时依托的竹节参(P.japonicas)bHLH1(登录号：ALB38667.1)、竹节参(P.japonicas)ERF1(登录号：ALB38666.1)、人参(P.ginseng)MYB1(登录号：APU53711.1)和PnWRKY1(登录号：AJG43747.1)的碱基序列拥有86.38%、93.03%、88.98%和98.36%的相似度，且均定位于4种TF DNA结合结构域的保守区内。在qRT-PCR中，4种TF的扩增曲线均呈平滑的S形，循环阈值为22～30，且溶解曲线都具单一峰。

M为DNA marker(2 kb)，B、E、M、W和G分别为bHLH、ERF、MYB、WRKY1和GAPDH，1和2为重复次数。

Note:M,DNA marker(2 kb). B, E, M, W and G represented the bHLH, ERF, MYB, WRKY1, and GAPDH, respectively. 1 and 2 represented two repeats.

图2 三七bHLH、ERF、MYB、WRKY1和GAPDH特征片段的琼脂糖凝胶电泳图谱

Fig.2 Agarose gel electrophorogram of the characteristic fragments of thebHLH,ERF,MYB,WRKY1, and

GAPDHofP.notoginseng

2.3 三七bHLH、ERF、MYB和WRKY1转录水平在绿紫茎中的纵向变化

从三七绿紫茎的顶端向基部，三七bHLH、ERF、MYB和WRKY1的相对转录水平表现为不同形式的曲线(图3)。bHLH的转录水平呈波动式平缓上升曲线，在茎段18处的水平最高，约为2.862(图3A)；F茎段≈25.58>F0.01(17，18)≈3.16，故bHLH转录水平在各茎段间的差异达极显著水平。ERF的水平表现为一条不规则7峰曲线，7个峰分别出现在茎段1、3、5、7、10、14和16，其相对表达量依次为1.000、1.297、1.507、1.071、1.241、1.686和1.598(图3B)；F茎段≈5.30>F0.01(17，18)≈3.16，故ERF转录水平在各茎段间的差异达极显著水平。MYB的水平表现为一条波动幅度逐渐增大的6峰曲线，在茎段15处的水平最高，为3.368(图3C)；F茎段≈16.31>F0.01(17，18)≈3.16，故MYB转录水平在各茎段间的差异达极显著水平。WRKY1的水平表现为一条近似2个主峰的6峰曲线，2个主峰分别出现在茎段9和茎段12，转录水平分别为1.708和1.921(图3D)；F茎段≈5.37>F0.01(17，18)≈3.16，故WRKY1转录水平在各茎段间的差异达极显著水平。此外，在任何茎段中，4种TF的转录水平也不一致(图4)，如：在茎段5，ERF和MYB的水平最高，bHLH的次之，WRKY1的最低。可见，4种TF在三七绿紫茎中的转录水平具有组织(不同茎段)特异性。

注：A、B、C和D分别表示bHLH、ERF、MYB和WRKY1。

Note: A, B, C and D represented thebHLH,ERF,MYB, andWRKY1, respectively.

图3 三七紫茎中bHLH、ERF、MYB和WRKY1转录水平的纵向变化

Fig.3 Longitudinal variations of the transcriptional levels of thebHLH,ERF,MYBandWRKY1 ofP.notoginseng

图4 三七bHLH、ERF、MYB和WRKY1在三七绿紫茎中的相对转录水平热图

Fig.4 Heatmap of the relative transcriptional levels of thebHLH,ERF,MYBandWRKY1 in the purplish-green stems ofP.notoginseng

2.4 三七绿紫茎中总三萜皂苷含量的纵向变化

从图5可知，自三七绿紫茎的顶部向基部，总三萜皂苷含量(TTSC)总体呈1条V形曲线，最低TTSC出现在茎段7，为3.837 mg/g FW；三萜皂苷主要集中在茎黄金分割点的下部，其含量约是上部的1.7倍，占整个茎段TTSC的63.2%；经方差分析，F茎段≈248.578>F0.01(17，18)≈3.16，故TTSC在不同茎段间的差异达极显著水平。

注：1～18表示茎从顶部向基部被均分为18段。

Note:1～18 indicated that the stems were evenly divided into 18 segments from the tops to the bases.

图5 三七绿紫茎中总三萜皂苷含量的纵向变化

Fig.5 Longitudinal variations of the total triterpenoid saponins in the green-purple stems of

P.notoginseng

2.5 三七绿紫茎中bHLH、ERF、MYB和WRKY1转录水平与总三萜皂苷含量间的相关性

从表2可知，在三七绿紫茎中，三七bHLH、ERF、MYB和WRKY1转录水平与三萜皂苷含量(TTSC)间的Pearson相关系数分别为0.371、0.130、-0.169和-0.195，可见，与绿紫茎三萜皂苷合成相关的主要转录因子基因为bHLH，其次为ERF。同时，4种转录因子基因转录水平间的Pearson相关系数不同，bHLH与ERF间、bHLH与WRKY1间、ERF与MYB间均呈不显著正相关。所以，在三七绿紫茎中，4种转录因子基因没有构建成共转录群。

表2 三七绿紫茎中4种转录因子基因的转录水平间及总三萜皂苷含量间的Pearson相关系数

Table 2 Pearson correlation coefficients between the transcriptional levels of thebHLH,ERF,MYBandWRKY1 ofP.notoginsengand the total triterpenoid saponin content as well as those among the four TFs in the green-purple stems ofP.notoginseng

项目ItembHLHERFMYBWRKY1TTSC0.3710.130-0.169-0.195bHLH10.275-0.0170.106ERF10.410-0.399MYB1-0.337WRKY11

3 结论与讨论

研究发现，从三七绿紫茎的顶部到基部，三七bHLH、ERF、MYB和WRKY1的转录水平分别呈1条波动式平缓上升、不规则7峰、波动幅度逐渐增大的6峰和2个主峰的6峰曲线；其中，bHLH主要在茎的中部和基部表达，ERF转录水平的7个峰分别出现在茎段1、3、5、7、10、14和16，MYB主要在茎的中部表达，WRKY1转录水平的2个主峰分别出现在茎段9和12，WRKY1主要在茎的中部表达；三七绿紫地上茎的总三萜皂苷含量(TTSC)大体呈V型曲线，最低TTSC出现在茎段7，即茎上部的黄金分割点处，黄金分割点下部TTSC约是上部的1.7倍。4种转录因子基因转录水平和TTSC在不同茎段间的差异均达极显著水平。bHLH、ERF、MYB和WRKY1转录水平与TTSC间的Pearson相关系数分别为0.371、0.130、-0.169和-0.195，表明与三七绿紫茎三萜皂苷合成相关的主要转录因子为三七的bHLH，其次为ERF，而MYB和WRKY1对皂苷的合成无正面贡献，其分子原因暂不明。同时，4种TF对三七其他器官三萜皂苷合成的差异性调控效应尚待研究。

对于bHLH、ERF、MYB和WRKY在不同种的高等植物的三萜皂苷生物合成中，发挥主要调控作用的转录因子不尽相同。如调控蒺藜苜蓿(Medicagotruncatula)三萜皂苷合成的主要转录因子为bHLH[17]，但调控西洋参(Panaxquinquefolius)三萜皂苷合成的主要转录因子却为WRKY[18]。另一方面，除bHLH、ERF、MYB和WRKY外，可能还有其他转录因子参与包括三七在内的高等植物三萜皂苷生物合成的转录调控，如：同源异型盒(homeobox)和碱性亮氨酸拉链(basic leucine zipper, bZIP)可能也参与了调控三七三萜皂苷的生物合成[1]。可见，调控高等植物三萜皂苷生物合成的转录因子具有明显的种特异性和多样性特征。