贵州糯质高粱GBSSI基因型的鉴定

邓小锋，陈满静，曹绍书，谭金玉，陈柔屹，程 江，周棱波，郑常祥

(1.贵州省农业科学院 旱粮研究所，贵州 贵阳 550006； 2.贵州省农业科学院 农作物品种资源研究所，贵州 贵阳 550006)

高粱〔Sorghumbicolor(L.) Moench〕是世界第五大作物，种植面积仅次于小麦、玉米、水稻和大麦，广泛用于饲料、粮食、酿造加工和能源等行业[1]。高粱籽粒营养成分丰富，其中含粗淀粉约75%，粗蛋白11%，脂肪3%，纤维2.5%～4%，与玉米饲用能效相当[2-3]。淀粉是植物光合产物碳水化合物的主要储存形式。根据不同生物学功能，植物淀粉分为过渡型淀粉和贮藏型淀粉。过渡型淀粉白天在光合组织中积累，晚上降解后为植物生长代谢提供物质与能量[4]，贮藏型淀粉储存于植物种子胚乳及块茎中，为发芽和再生提供能量[5]。禾本科植物胚乳中的淀粉粒由直链淀粉和支链淀粉组成，其合成和积累在造粉体中进行。右旋葡萄糖通过α-1,4糖苷键形成100～10 000个残基的线性葡聚糖链，其上分布有极少量的α-1,6糖苷键，其多糖为直链淀粉。若在10 000～100 000个残基的葡聚糖链上大量且规律分布着由α-1,6糖苷键形成的支链，其多糖为支链淀粉[6]。支链淀粉形成非定形晶状体薄片结构，直链淀粉的线性支链分布于支链淀粉间，使淀粉粒呈半晶体状[7]。

胚乳淀粉粒的合成是一个复杂而高度调控的过程，从1-磷酸葡萄糖进入造粉体后，至少涉及腺苷二磷酸葡萄糖焦磷酸化酶(ADP-glucose Pyrophosphorylase，AGPase)、淀粉合成酶(Starch Synthase，SS)、淀粉分支酶(Starch Branching Enzyme，SBE)和淀粉去分支酶(Starch Debranching Enzyme，DBE)4种酶的参与[6]。淀粉合成酶的功能是将底物腺苷二磷酸葡萄糖(Adenosine Diphosphate-glucose，ADPG)转移到葡聚糖链的非还原端，使葡聚糖链不断延伸。根据功能的不同又分为颗粒结合型淀粉合成酶(Granule-Bound Starch Synthase，GBSS)和可溶性淀粉合成酶(Soluble Starch Synthases，SS)[8]。颗粒结合型淀粉合成酶负责直链淀粉和支链淀粉特长链的合成，可溶性淀粉合成酶主要负责支链淀粉的合成。完整规则的高粱胚乳支链淀粉约占淀粉总量的70%～80%，直链淀粉约占总量的20%～30%[9-10]。

当高粱基因GBSS的功能缺失或者削弱后，籽粒胚乳呈糯质性状，也叫蜡质性状，胚乳中几乎无法合成直链淀粉，全是支链淀粉。典型的糯质胚乳纵切面是灰白色的光滑面，如同蜡烛的蜡或白玉的表面。一些糯质高粱的整个胚乳区域都呈蜡质状；一些糯质高粱的胚乳与胚的交界处有条状白色粉质区，其他区域为蜡质状；一些糯高粱胚乳中心有小的白色粉质区，周围是蜡质性状。由于形成蜡质性状，GBSS在早期被命名为Wx基因(Waxy,Wx)[11]。典型的粳高粱籽粒整个胚乳区呈白色粉质的粗糙面。一些高粱材料的籽粒由于胚乳的淀粉粒与蛋白质基质结合紧密，在外周胚乳形成了晶体状的角质[12]，角质性状在谷类作物籽粒普遍存在[13]，隐性的wx基因存在剂量效应。

从多种谷类作物都发现糯质突变体。玉米的AC或DS转座元件插入GBSSI基因中，使其不能正常翻译，形成糯质性状[14]。糯质水稻的GBSSI第一个内含子的5′剪接位点发生碱基突变，只能形成3.3 kb的未成熟mRNA，无法正常翻译[15]。从云南的地方水稻品种中发现，GBSSI的497号碱基发生突变，使GBSSI与淀粉颗粒的结合度降低，形成另一类型的糯质性状[16]。普通小麦含有3个GBSSI，分别为Wx-A1b，Wx-B1b和Wx-D1b。糯质小麦中，Wx-A1b编码区完全缺失，Wx-B1b和Wx-D1b编码区序列缺失一部分[17]。大麦中，GBSSI编码区上游启动子序列缺失降低了该基因的转录效率，同时GBSSI编码区的1个碱基错义突变，改变了该酶的保守结构域，使GBSSI完全失去功能[18]。

已知高粱的GBSSI有4种突变基因型。wxa的第3外显子处插入了约4kb的转座序列，wxb的一个碱基C突变为T，保守结构域的谷氨酸转变为组氨酸，使GBSSI活性降低[19]。wxa不能翻译成酶GBSSI，胚乳完全不能合成直链淀粉。wxb的GBSSI酶活性只有正常的75%。四川糯高粱分析鉴定出基因型wxc和wxd[20]。两者由于在第9外显子和第11外显子剪接处发生碱基缺失或者突变，造成编码框改变，翻译后的酶缺乏正常的功能。贵州糯高粱的wx基因型的分析研究已有报道[21]，但其针对的是糯高粱品种，且数量非常少。鲜见关于贵州省糯高粱基础资源鉴定的相关研究报道。为此，对前期工作中已经搜集的一批贵州地方高粱资源(包括地方种、农家种和野生高粱)进行糯质高粱的wx基因型鉴定，以期为贵州地方高粱资源在育种中应用提供科学依据。

1 材料与方法

1.1 材料

高粱材料：用于糯质分析的高粱材料(贵州地方种、农家种和野生高粱)共计252份，前期工作中搜集。其中，贵州省资源226份，省外资源20份，育种中间材料5份，贵州地方品种1份。

1.2 方法

1.2.1 胚乳性状的鉴定 收集的基础资源中，许多材料的wx等位基因为杂合状态，包括不同基因型及某种基因型在胚乳的不同拷贝数。通过快速鉴定籽粒胚乳的剖面性状来确定糯质材料。每份材料随机选8～10颗饱满籽粒，经纵切后进行剖面观察鉴定，不同胚乳性状分别用数字1、2、3和4进行标识。

数字1：籽粒整个胚乳区呈灰白色不透明蜡质状；胚乳与胚的交界处有细小条状粉质区，其余区域为蜡质状；胚乳中心有细小的白色粉质区，周围是蜡质状；整个胚乳区呈更白的不透明蜡质状。

数字2：从胚至种子顶端有一条白色粉质区域，该区域最多约占胚乳面积的1/2，其余部分呈蜡质状。若某材料的4～5颗籽粒呈前述蜡质胚乳，该材料将用于基因型鉴定。材料角质性状通过观察相同纵切剖面进行鉴定，并记载角质占剖面的面积。

数字3：角质胚乳。

数字4：完全粉质胚乳。

1.2.2 DNA提取 共鉴定出121份糯质胚乳材料，其中100份材料用于后续wx基因型鉴定，2份角质胚乳材料作为对照。100份材料中包括基础材料94份，中间材料5份，贵州品种红缨子作为比较材料。每份材料约20粒种子播于发苗盘，各材料在3叶期时取5～8个单株的叶片进行混合。DNA提取采用改良CTAB法：约0.2 g混合叶片，放入1.5 mL PE离心管，加入液氮，用转枪研磨成粉末。每管加入预热的提取缓冲液500 μL，在65℃温浴1 h，每间隔10 min温和混匀1次。以10 000 r/min离心5 min，转移上清液至新离心管。每管加入8 μL的RNAse A(10 mg/mL)，37℃温浴20 min。短暂离心，加入500 μL氯仿∶异戊醇(24∶1)混合液，轻轻颠倒混匀10～15 min，直到混液呈白色乳浊状。12 000 r/min离心10 min，转移上清液至新离心管，再加入500 μL的氯仿∶异戊醇混合液，重复以上操作1次。沉淀DNA时，加入适量5 M/L NaAc溶液，混匀后加入2倍体积4℃预冷的95%乙醇溶液，-20℃放置1 h，于低温10 000 r/min离心10 min，吸出上液，加入预冷的75%乙醇洗涤，10 000 r/min离心5 min，吸出上液。再重复洗涤1次。10 000 r/min离心1 min后，吸出残留乙醇，敞开管盖置于干净环境10～15 min，随后每管加入100 μL ddH2O，DNA充分溶解后，用微量分光光度计和琼脂糖电泳检测DNA的浓度和质量。缓冲液提取：100 mM Tris-HCL(pH 7.5)，25 mM EDTA，1.5 M NaCl，2%(w/v)CTAB。0.3%(v/v)β-mercaptoethanol，在缓冲液预热前加入。

1.2.3wxa基因型的检测 参照文献[19]的方法合成引物，引物序列(5′～3′)：Wxa-F，CGTGGCGAGATCAAACTCTA;Wx-F,GGCCTGGATTCAATGTTCTT；Wx-R，CTGGTTGTCCTTGTAGTCCGTT； PCR体系共25 μL：ddH2O 13.25 μL，10×buffer 2.5 μL，引物各2 μL，dNTP 0.75 μL，DNA 2 μL，Pfu酶0.5 μL。 PCR程序：98℃预热1 min，98℃ 30 s，48℃ 30 s，72℃ 1 min 2 s，共计35个循环，4℃冷置。产物于2%琼脂糖凝胶中120 V电泳，凝胶成像系统拍照，标记Marker为 Marker J。

1.2.4 检测wxb基因型 根据Sattler方法合成引物[19]，引物序列(5′～3′)：Wxb-F，CGACCGTGTGTTCATTGACCAC；Wxb-R TTGTTCAGTGCCTTTGCCTCG。PCR体系共25 μL：ddH2O 14 μL，10×buffer 2.5 μL，引物各2 μL，dNTP 1 μL，DNA 3 μL，Pfu酶0.5 μL。PCR程序：98℃预热1 min，98℃ 30 s，54.6℃ 30 s，72℃ 2 min 34 s，共计40个循环，4℃冷置。标记Marker为 Marker J。

1.2.5 检测wxc基因型 参照文献[20]的方法进行改动，为提高PCR扩增效率，重新设计引物。引物序列(5′～3′)：Wxc-F，TCGTCAACGGCATGGACGTCAGCGAG；Wxc-R，GCCGGCCATGATGTGGTGTGCCAG。PCR体系共25 μL：ddH2O 14 μL，10×buffer 2.5 μL，引物各2 μL，dNTP 1 μL，DNA 3 μL，Pfu酶0.5 μL。PCR程序：98℃预热1 min，98℃ 30 s，64℃ 30 s，72℃ 1 min 4 s，共计35个循环，4℃冷置。PCR产物酶切反应体系 20 μL：ddH2O，13.5 μL，10×buffer B 2 μL，PCR DNA 4 μL，HphI 5 U。37℃温浴16 h，于3%琼脂糖凝胶中120V电泳1 h，凝胶成像系统拍照。标记Marker为 Marker J。

1.2.6 检测wxd基因型 参照文献[20]的方法进行改动，为提高PCR扩增效率，重新设计了PCR引物。引物序列(5′～3′)：Wxd-F，CGCTGCTCATGGAGGAGGACATACAGATCGTT,Wxd-R,AGGGCTCGAAGCGGCTGGTGACGG。PCR体系共25 μL：ddH2O 14 μL，10×buffer 2.5 μL，引物各2 μL，dNTP 1 μL，DNA 3 μL，Pfu酶0.5 μL。PCR程序：98℃预热1 min，98℃ 30 s，63℃ 30 s，72℃ 33s，共计35个循环，4℃冷置。PCR产物酶切反应体系 20 μL：ddH2O 11.5 μL，10×buffer SduI 2 μL，PCR DNA 6 μL，SduI 5 U。酶切在37℃温浴16 h，于3%的琼脂糖凝胶中120 V电泳1 h，凝胶成像系统拍照。标记Marker为 Marker A。

2 结果与分析

2.1 102份高粱材料的胚乳性状

标记为1的材料蜡质化程度高于标记为2的材料，3为角质籽粒，4为粉质籽粒。从表1可知，D58和E48(对照)籽粒的剖面性状分别为3(4/5)和3(5/6)。其余100份高粱材料中，籽粒剖面性状标记为1的有D1、E3和E40等11个材料，标记为2的有A5、B19和B37等45个材料，标记为2、1或1、2的有B11、B45和C20等30个材料，标记为2、1、3或3、1、2的有D91和E52，标记为1、2、4或2、4、1的有E26、A13和F19等5个材料，标记为2、4的有F29，标记为3、2或2、3的有A25、F40和F13等4个材料。可见，许多糯质高粱材料之间籽粒蜡质化程度及多份材料内部的籽粒蜡质化程度均不同，揭示许多材料含有杂合的wx基因型，还含有野生型Wx，同时许多材料籽粒间糯质基因型的拷贝数不同，形成了籽粒蜡质化程度的多样性。

表1 102份高粱材料籽粒的胚乳性状

注：从鉴定的糯质胚乳材料中选择100份进行wx基因型分析，角质胚乳材料D58和E48为对照；括号内数据表示角质占剖面的面积。

Note:wxgenotype of 100 accessions selected from indentified glutinous endosperm accessions is analyzed. D58 and E48 of keratin endosperm are as the control. The data in bracket means the area of keratin in section.

2.2 不同基因型的检测

2.2.1wxa基因 在102份材料中，若PCR产物含611 bp条带即为wxa基因型，含519 bp条带为非wxa基因型。从图1看出，基因型为纯合wxa的材料有68份，基因型为非wxa的材料有23份，含有双带基因型的杂合材料有11份。23份非wxa材料和11份含有双带基因型的杂合材料共计34份材料用于后续wxb、wxc基因型的检测。

注：M为Marker(下同)；D85鉴定2次。

Note:M, Marker (the same below); D85 tested twice.

图1 102份材料wxa基因型的检测结果

Fig.1 Detection result ofwxagenotype in 102 accessions

2.2.2wxb基因型 从图2看出，在14份材料中，扩增产物中包含1 282 bp的目标条带，但也包含约350 bp的杂带1条，且杂带的亮度高于目标条带。因此，Sattler方法的引物无法用于检测14份高粱材料的wxb基因型，需要重新设计特异性引物。

2.2.3wxc基因型 若PCR产物为529 bp单条带即为wxc基因型。产物被HphI酶切为452 bp和77 bp的材料为非wxc基因型。从图3可知，基因型为纯合wxc的材料有8份，基因型为非wxc的材料有11份，含有3条条带的杂合材料基因型有15份。结合wxa基因型的检测结果，11份非wxc材料中，同时含有wxa基因型和未鉴定基因型的材料为B46、C17和E52，其他8份材料的基因型为非wxa和非wxc。15份杂合材料中，B19等7个材料不含wxa，除含有wxc外，还含有野生型或未鉴定的基因型。B30等8个材料含有wxa和wxc，但可能还含有野生型等其他基因型。15份杂合材料和11份非wxc材料用于后续wxd基因型的检测。

2.2.4wxd基因型wxd基因型检测中，若PCR产物不能被SduI酶切为269 bp单条带的材料为wxd基因型，产物被酶切为148 bp、115 bp和6 bp的材料为非wxd基因型，6 bp片段由于长度短，电泳过程中析出凝胶外，在检测时不可见。含有3条条带的材料为杂合型。从图4看出，基因型为纯合wxd的材料有6份，基因型为非wxd的材料有18份，基因型为wxd和其他基因型的杂合材料有2份。结合材料wxa和wxc基因型的检测结果，确定杂合材料B19含wxc和wxd基因型，B46含wxa和wxd基因型。非wxd的18份材料中，B30、D86、E9、II137、E7、F31和E40是wxa和wxc基因型；B17除含wxa和wxc基因型外，可能还含有野生型等其他基因型；C17和E52含wxa和野生型等其他基因型；B45、A25、F29、C27、F19和F15含wxc和野生型等其他基因型；D58和E48不含wxa、wxc及wxd基因型。

3 结论与讨论

研究结果表明，100份糯质材料通过wxa、wxc和wxd基因型的检测，GBSSI位点为纯合wxa的材料有68份，纯合wxc的材料有8份，纯合wxd的材料有6份；位点包含2种糯质基因型的材料有9份。其余9份材料中，8份材料除含1种糯质基因型外，还含有野生型等未鉴定基因型；1份材料除2种糯质基因型外，可能还含有野生型等未鉴定的基因型。D58和E48不含wxa、wxc及wxd基因型。研究发现，wxb鉴定方法不成熟，未进行wxb的鉴定。

研究结合籽粒剖面蜡质鉴定方法和3种wx基因型分子鉴定方法，在不测量籽粒支链淀粉含量的前提下，快速分析高粱糯质资源的wx基因型，为后续研究和应用提供有用信息。研究同时发现，部分材料的籽粒剖面鉴定结果与分子鉴定结果间有偏差。如PCR鉴定出纯合wxa的材料68份，无Wx野生型，但在籽粒剖面性状鉴定中，B5和B41等部分材料的蜡质标识为2，即在检测的8粒籽粒中，纵切剖面胚乳区域含有1条白色粉质区。预示这些材料除含wxa外，还含Wx野生型。推测偏差原因：一是进行剖面蜡质性状鉴定和PCR分子鉴定的籽粒为同1份材料的不同籽粒。研究中的糯质高粱来自农家种和地方栽培种等，同1份材料的不同籽粒间糯质性状有差异。二是部分糯质材料的Wx野生型量远少于wxa基因型量，由于PCR过程中 3种引物添加到同一反应体系中，Wx野生型模板无法扩增出足够的量显示出来。在后续试验中，一是改纵切为横切，完成籽粒剖面性状的鉴定后，将含有胚的部分进行发芽，其DNA用于分子鉴定，性状鉴定和分子鉴定的结果将更一致。二是在wxa基因型检测中，2种反向引物分别添加到不同PCR体系，通过扩增微量模板，提高鉴定的灵敏度。

在后续研究中，需进一步鉴定4种wx糯质基因型籽粒中不同wx基因拷贝数下籽粒剖面的性状差异。wxa基因型无法合成有活性的GBSSI酶，wxb合成的酶活性约为野生型的20%，未见wxc和wxdGBSSI酶活性的研究报道[19]。4种wx基因型间及同种wx基因型的不同拷贝数间，籽粒剖面性状、支链淀粉含量均存在差异。鉴定wxb基因型时发现，SATTLER等[19]报道的引物特异性不高。因此，需要重新设计特异引物。研究反映出搜集的高粱糯质资源材料的等位基因较丰富，在后续繁种保存过程中，需多株繁种，防止有益等位基因的丢失。