祛积通络方对RVO 大鼠视网膜HIF-1α、VEGF mRNA 表达的影响

郝晓凤，谢立科，胥静，黄少兰，金琪，孙梅，李晓宇，张小艳，王诗惠，吴改萍

视网膜静脉阻塞（retinal vein occlusion，RVO）是以视网膜静脉充血扩张为特征的一类视网膜血管病，常继发视网膜内出血、水肿或缺血，当黄斑水肿累及中心凹时，出现急性无痛性视力下降，分为视网膜中央静脉阻塞和分支静脉阻塞两类[1]，是仅次于糖尿病视网膜病变的第二大致盲性视网膜血管病[2-4]。大量研究[5-7]证实，血管内皮生长因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）是RVO 发生发展中最关键的因子，VEGF 可致血管通透性增加，加重血-视网膜屏障功能破坏，引起视网膜出血、渗出及水肿，并加重组织缺氧；同时，缺氧可使缺氧诱导因子1α（hypoxia-inducing factor 1α，HIF-1α）去羟基化、活性增加，又促进VEGF 释放，形成恶性循环。由此可见，HIF-1α/VEGF 通路参与了RVO 的发生发展。中医学将其归属于“络损暴盲”“血证”范畴[2],中药祛积通络方在RVO 所致的黄斑水肿（macular edema，ME）的临床治疗中取得了较为显著的效果[8]，理论上可以减轻眼底出血、水肿和渗出，修复视网膜微血管损伤。本研究通过光化学动力法建立大鼠RVO 模型，观察祛积通络方对实验型RVO 大鼠视网膜HIF-1α、VEGF mRNA 表达的影响，初步探讨中药治疗RVO 眼底出血、水肿、渗出的作用机制。

1 材料与方法

1.1 实验动物

健康成年雄性BN 大鼠（购于中国医学科学院实验动物中心，许可证号：SYXK（京）2014-0043）60 只，SPF 级，体重180～200 g，无眼疾。实验动物及实验所用条件符合国家科学技术委员会的《实验动物管理条例》相关规定。

1.2 试剂与仪器

1.2.1仪器 眼底激光仪（德国海德堡公司）、眼底血管造影仪（德国海德堡公司）、切片机（美国Leica 公司）、PCR 仪（ABI 公司）、离心机（上海卢湘仪离心机仪器有限公司）、电动匀浆机（FLUK）。

1.2.2试剂 复方托吡卡胺滴眼液（日本参天制药株式会社）、盐酸奥布卡因滴眼液（日本参天制药株式会社）、孟加拉红和戊巴比妥钠注射液（广西梧州制药有限公司）、荧光素钠注射液（美国Alcon 公司）、SYBR Green PCR 试剂盒 （Thermo）、逆转录试剂盒（Fermentas）、HIF-1α、VEGF 多克隆抗体（Abcam）。

1.3 实验药物

祛积通络方由桃仁、红花、当归、生地黄、茯苓、半夏、三七、陈皮、鸡内金、防风组成，参考《药理实验方法学》[9]用量与浓度按有色鼠与人用药量比进行换算（MechRubner 公式），配制临床等效剂量浓度1.0 g/L生药。复方血栓通胶囊由广西梧州制药有限公司提供。

1.4 方法

1.4.1RVO 动物模型的建立[10]BN 大鼠用10 g/L 戊巴比妥钠按40 mg/kg 体质量腹腔注射麻醉，右眼滴盐酸奥布卡因滴眼液表面麻醉，滴复方托吡卡胺滴眼液散瞳10 min，3%孟加拉红30 mg/kg 经大鼠尾静脉缓慢注入0.25 ml。给药3 min 后，大鼠角膜上安置滴加氧氟沙星眼膏的三面镜，于伴行动脉距离较远的静脉，从静脉远端向视乳头方向，采用波长532 nm 绿光进行激光照射，远端血管变细后，可以增加参数照射近端血管，观察血流完全中断，则可形成1 个视盘直径（disc diameter，DD）左右的静脉血栓或阻塞，每支血管平均照射25～30 点，每只眼间隔选3 支静脉血管建立RVO 模型。激光照射后大鼠避光12 h。激光治疗参数：功率80～100 mW，光斑直径50～100 μm，激光照射时间0.4～0.6 s 进行血管照射。

1.4.2动物分组与处理 60 只BN 大鼠随机分为6组，每组10 只。正常空白组（正常组）：不造模，正常喂养，自由饮水；模型组：造模成功后，按给药组等量蒸馏水灌胃，每日1 次；阳性对照组（对照组）：造模成功后，将复方血栓通胶囊内药物溶于水中灌胃，根据人与大鼠按体表面积折算的等效剂量比值计算等效剂量[9]，确定给药剂量为0.2 g/kg/d，每日1 次；祛积通络低剂量组（低剂量组）、祛积通络中剂量组（中剂量组）、祛积通络高剂量组（高剂量组）：造模成功后，采用祛积通络方灌胃给药，给药剂量经计算后分别为0.8 g/L、1.0 g/L、1.2 g/L，每日1 次，每次2 ml。治疗28 d。

1.5 眼底荧光血管造影检查

于造模后1 h 随机选取各组大鼠5 只，行眼底荧光血管造影（fluorescein fundus angiography，FFA）检查，腹腔注射10 g/L 戊巴比妥钠（40 mg/kg）麻醉后，腹腔注射10%荧光素钠注射液（0.1 ml/100 g），并立即用眼底照相机进行观察照相。并于造模后7 d，随机取模型组大鼠5 只，观察FFA 眼底相。

1.6 RT-PCR 检测

观察视网膜HIF-1α、VEGF mRNA 的表达水平。各组分别于造模后1 h、28 d 处死大鼠，显微镜下去除眼前节、晶状体、玻璃体，分离视网膜组织标本。利用RNA 提取试剂盒步骤提取总RNA，反转录cDNA，采用Real-time PCR 仪进行扩增。PCR 引物探针设计[11]见表1。PCR 反应体系的配制（总体积25 μl）：SYBRGreen Mix 10 μl、上游引物和下游引物各1 μl、ddH2O 11 μl、cDNA 模板2 μl，总体积25 μl 置于扩增程序。PCR 扩增体系设置：95℃×10min（95℃×15s；55℃×45s）循环40 次；冷却后再升温至95℃×15s；60℃×1 min；95℃×15 s；60℃×15 s。60℃检测信号。

表1 RT-PCR 引物序列

1.7 统计学方法

采用SPSS 11.0 软件进行统计分析，计量资料采用均数±标准差（±s）表示，比较采用单因素方差分析，组间两两比较采用LSD-t 检验，以P＜0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 模型的鉴定及RVO 大鼠FFA 特征

空白组大鼠FFA 示视网膜血管呈放射状走行，静脉管径均匀，充盈良好，未见荧光渗漏（图1A）。各组造模后1 h，上方阻塞的静脉无荧光显示，静脉粗细不均，箭头处可见血流中断，说明模型成功建立（图1B）；模型组造模后7d，可见阻塞的静脉迂曲扩张，出血遮蔽，视网膜色素沉着，部分血管可再通（图1C）。

图1 各组大鼠FFA 图像。1A 空白组；1B 各组造模后1 h，视网膜静脉血流中断，阻塞的静脉无荧光显示（红箭头）；1C 模型组造模后7 d，阻塞的静脉迂曲扩张，粗细不均，可见血管再通现象（红箭头）

2.2 视网膜组织中HIF-1α、VEGF mRNA 的表达

数据采用仪器自带软件分析：ABI Prism 7300 SDS Software。各组溶解曲线均为单一型的曲线，没有引物二聚体等非特异扩增曲线，引物设计及反应条件良好。

HIF-1α mRNA 表达：在正常组有微量表达，造模后其他组相对表达量均增加。造模后1 h，各组间比较，差异无统计学意义（F=2.489，P=0.088）。造模后28 d，对照组和低、中、高剂量组表达水平相对于模型组均下降，各组组间比较，差异有统计学意义（F=7.981，P=0.007）；低剂量组与对照组比较，差异无统计学意义（t=0.541，P=0.597）；中、高剂量组与对照组比较，t中剂量组=3.071，P=0.037；t高剂量组=4.620，P=0.010；中、高剂量组之间比较，t=3.147，P=0.035，差异均有统计学意义。

VEGF mRNA 表达：在正常组有微量表达，造模后其他组相对表达量均增加。造模后1 h，各组间比较，差异无统计学意义（F=4.327，P=0.055）。造模后28 d，对照组和低、中、高剂量组表达水平相对于模型组均下降，各组组间比较，差异有统计学意义（F=5.563，P=0.021）；对照组与三种剂量组比较，t低剂量组=3.221，P=0.032；t中剂量组=4.349，P=0.012；t高剂量组=5.689，P=0.005；低剂量组与中、高剂量组比较，t中剂量组=3.113，P=0.032；t高剂量组=7.612，P=0.001；中、高剂量组比较，t=5.805，P=0.005，差异均有统计学意义（表2）。

表2 HIF-1α mRNA 和VEGF mRNA 表达量RT-PCR 半定量分析（±s，n=5）

表2 HIF-1α mRNA 和VEGF mRNA 表达量RT-PCR 半定量分析（±s，n=5）

注：△与正常组比较，P＜0.05；# 与模型组比较，P＜0.05；* 与对照组比较，P＜0.05；HIF-1α 缺氧诱导因子1α；VEGF 血管内皮生长因子

3 讨论

RVO 发生机理有两大学说，一是血栓形成学说[12-13]，一是静脉功能性调节障碍[6,14-15]。后者由临近的病变动脉或缺氧组织释放血管收缩分子内皮素（Endothelin-1，ET-1）和VEGF，引起血管收缩、组织缺血、代谢紊乱和细胞增殖等血管损伤，大量VEGF释放致血管通透性增加，加重血-视网膜屏障功能破坏，从而引起视网膜出血、渗出及水肿[16]。VEGF是公认的RVO 发生中最关键的因子。VEGF 可促进血管细胞粘附分子（vascularcelladhesionmole-1，VCAM-1）过量表达，进一步介导白细胞和血管内皮细胞间粘附作用增强，增多的VCAM-1 又可与中性粒细胞结合，随着血流滚动于血管内壁，最后粘附于血管表面，使白细胞停滞、血液流通受限，最终导致血栓形成或组织中的血供受限，从而损伤组织，加重视网膜缺血缺氧。同时，组织缺氧时，可使HIF-1α 去羟基化、活性增加，促进VEGF、VCAM-1 等因子释放，形成恶性循环[6,16]。因此，推测HIF-1α/VEGF 通路参与了RVO 疾病的发生与发展。

中医认为，RVO 的基本病机脉络瘀阻，血外溢于目，“血瘀”是RVO 最突出的病机[17]。主要致病因素有情志内伤、肝气郁结；肝肾阴亏、肝阳上亢；过食肥甘厚味、痰湿内生[18]。课题组从“络病”入手，认为RVO 因邪犯目络，络中气机阻滞，血行瘀滞，或痰凝津结、阻塞络道，发为本病，在RVO 疾病发生发展中，气、血、痰、瘀、水等病理因素往往相互缠绵共存一体，与眼底出血、水肿、渗出、缺血、新生血管形成等相对应，因此，提出脉积理论，将本病病机归为“络损积阻”，治法以“祛积通络”为主[19-20]。课题组前期临床研究已证实，祛积通络方可以有效缓解眼底出血、水肿，修复微血管损伤。因此，需要通过动物实验进一步探讨中药祛积通络方治疗RVO 的作用机理。

本研究采用光化学法制作大鼠RVO 动物模型，将光敏药物孟加拉红注入大鼠静脉后，激光照射视网膜血管，在光敏药物与照射激光的共同作用下形成RVO 模型[10]。在所有文献报道的RVO 动物模型中，光化学法最容易在视网膜血管形成血栓，与其他造模方法相比，光化学法模型制作简单、快速、重复性好，短时间内即可制作成功，造成血小板聚集及血管内皮细胞损伤，且模型动物存活时间长，为各种药物研究提供了可能性。模型应用光化学法时应注意的是激光能量不宜过大，避免局部爆破作用击破Bruch 膜直接形成脉络膜新生血管 （choroidal neovascularization，CNV）；光斑直径也不宜过大，防止损伤范围过大[21]。但由于啮齿类动物没有黄斑，因此，大鼠RVO 模型不能模拟人类RVO 继发黄斑水肿的模型，仅在血栓形成、视网膜出血、水肿、渗出及微环循功能受损等病理表现上有一致性。

本研究以复方血栓通胶囊作为阳性对照，研究[22]表明，复方血栓通胶囊可能降低视网膜新生血管中VEGF 的表达。本文发现中药祛积通络方中、高剂量组对HIF-1α、VEGF mRNA 有抑制作用，且在抑制HIF-1α、VEGF 蛋白的表达上，也得到类似的结果，说明中药祛积通络方可从转录水平抑制HIF-1α/VEGF，从而抑制RVO 疾病发展。

祛积通络方中桃仁、红花、当归、三七均具有抗凝血、抗血栓功能；红花能抑制血小板聚集、扩张血管、改善微循环，红花、当归萃取液能阻止内皮细胞过度增生，稳定血管内膜，且具有抗炎作用；当归对缺血损伤具有保护作用；三七有止血、补血功能；地黄具有止血、强心、利尿、降血糖、抗炎、保肝等作用；桃仁、当归、地黄均具有抗炎、抗自由基、抗肿瘤及增强免疫力等作用。陈皮具有抗血小板聚集、抗氧化作用；半夏有燥湿化痰，降逆止呕，与鸡内金均有消痞散结之功效；茯苓具有抗菌抗炎抗病毒、利水消肿、抗肿瘤抗衰老以及调节免疫功能。防风主要有抗炎、抗菌、抗肿瘤、提高机体免疫功能、抗过敏、抗凝血等药理作用。以上药物合用，不仅可增强止血、活血、改善微循环、防止血栓形成的作用；同时加入燥湿化痰，消痞散结，利水消肿诸药，可促进瘀血水肿吸收。因此，祛积通络方治疗RVO 模型大鼠不仅发挥了中药多靶点治疗优势，在经济学意义上也占优势。

本实验动物模型视网膜血管的阻塞是在健康的血管床上光化学动力诱导而成的，而人RVO 患者年龄多在40 岁以上，多合并其他全身血管性疾病，如高血压病、高脂血症、糖尿病、高酮症氨酸血症等，有血管壁、血液流变学及血液动力学的改变。如果能在具有全身血管病变、出现代谢综合征的动物中进一步制作RVO 模型，可能更接近人的RVO 病理状态。所以本动物模型实验结论的合理性是相对的，需要通过逐步完善实验，最终找到人体疾病发生的真正原因，找到更精准的治疗方案[21]。