上海地区孤立性心房颤动患者GATA-4基因突变的研究

谢娟，王文安，施德

心房颤动（房颤，AF）是人类最常见的心律失常，导致中风[1]，老年痴呆症[2]和心力衰竭的风险增加[3]。房颤是一种与遗传因素显著相关的心律失常。转录因子在导致心律失常易患性增加方面发挥重要的潜在作用，同时，转录因子在房颤相关的心房重构中也发挥着重要作用。心脏转录因子GATA-4是一种在心脏中大量表达的锌指转录因子，在心血管发育、心肌重构与肌细胞凋亡方面发挥着重要的生理作用[4]，近年来的研究显示，GATA-4基因突变也可导致房颤的发生[5]。不同人群致病突变并不相同。本研究探讨上海崇明地区孤立性房颤患者GATA-4基因突变情况，报道如下。

1 资料与方法

1.1 研究对象选择2016年12月～2018年9月100例无血缘关系的上海崇明地区孤立性AF患者，分别来自上海交通大学医学院附属新华医院崇明分院神经内科及心内科，其中男性61例，女性39例。根据2014年美国心脏协会/美国心脏病学会/美国心律学会（AHA/ACC/HRS）关于孤立性AF的诊断标准选择研究对象：①发病年龄≤60岁；②经体表心电图或动态心电图检测确诊为AF（无P波，代之以形态、振幅、间距绝对不规则的AF波f波，发作时心室率高达350～600 次/min；心室律绝对不规则；QRS波多形态正常，但振幅不一致）；或既往有AF史及药物或消融治疗史；③通过彩色多普勒超声心电图及辅助检查排除心脏器质性病变及其他危险因素，如风湿性心脏瓣膜病、高血压、冠状动脉性心脏病、心功能衰竭、糖尿病、甲状腺功能异常、心肌病、心肌炎、预激综合征、先天性心脏病、 胸外科手术后、电解质紊乱等。此项研究获得上海交通大学医学院附属新华医院崇明分院伦理委员会批准，所有受试者均签署知情同意书。

1.2 研究方法

1.2.1 基因组DNA提取患者住院72 h内取EDTA抗凝血4 ml，应用血液基因组 DNA抽提试剂盒（EZ-10 Spin Column Blood Genomic DNA Purification Kit，上海生工）提取全血基因组DNA，-20℃保存。

1.2.2 引物设计采用Primer 5.0软件设计引物10对（表1），分别扩增 GATA-4基因7个外显子。引物由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。

1.2.3 PCR反应条件PCR反应体系为13.5 μl，其中基因组DNA2 μl，GATA-4 上、下游引物各2 μl，dNTP（mix）2 μl，Taq Buffer 5 μl，Taq酶 0.5 μl。扩增条件：预变性 95℃ 5 min，变性94℃ 30 s，退火60℃ 30s，延伸72℃ 50s，循环35次，修复延伸72℃ 8 min。用1%的琼脂糖凝胶电泳观察 PCR 产物扩增情况。

表1 各外显子引物序列及扩增片段长度

1.2.4 DNA测序及突变分析PCR产物采用 纯化回收试剂盒（B518141，上海生工）纯化回收后进行测序PCR反应，应用 ABI3730XL全自动DNA测序仪（美国ABI）进行序列测定，sequence analysis软件进行序列分析，将测序结果与美国国立生物技术信息中心（National Center for Biotechnology Information，NCBI）的 GenBank数据库中GATA-4基因外显子标准序列进行比对，明确核苷酸变异的位点和类型。

2 结果

2.1 GATA-4基因2号外显子突变1例孤立性房颤患者GATA-4基因2号外显子第541位碱基发现杂合同义突变（c.541C＞T，p.His28His），2例孤立性房颤患者GATA-4基因2号外显子第556位碱基发现杂合同义突变（c.556G＞T，p.Ala33Ala）（图1～2）。

图1 GATA-4基因2号外显子第541位碱基杂合突变测序图

图2 GATA-4基因2号外显子第556位碱基杂合突变测序图

2.2 GATA-4基因3号外显子突变3例孤立性房颤患者GATA-4基因3号外显子第102位碱基发现杂合错义突变（c.102G＞A，p.Ala240Thr），图3。

图3 GATA-4基因3号外显子第102位碱基杂合突变测序图

2.3 GATA-4基因6号外显子突变8例孤立性房颤患者GATA-4基因6号外显子第49位碱基发现杂合错义突变（c.49A＞G，p.Asn349Ser），图4。

图4 GATA-4基因6号外显子第49位碱基杂合突变测序图

3 讨论

转录因子GATA家族是一类具有锌指结构的细胞核转录因子，其共同特点是能够特异性识别并直接结合靶基因启动子中的一致性DNA序列（A/T）GATA（A/T）。GATA家族有6个成员，GATA-1、GATA-2、GATA-3与造血系统及外胚层衍生物的形成有关；GATA-4、GATA-5、GATA-6主要负责胚胎期心脏的发育及内胚层组织的分化[6,7]。研究表明，GATA-4、GATA-5和GATA-6在心血管的正常发育、结构重构和功能适应等方面具有重要作用，GATA-4、GATA-5、GATA-6基因缺陷可导致多种类型的先天性心脏病[8-10]及AF[11-14]，其中GATA-4是研究较多且是最早发现与AF有关的心脏转录因子。

人类G A T A-4基因位于染色体8 p 2 3.1-p22[15]，有7个外显子，编码一种含有442个氨基酸、相对分子质量约为45 000的核蛋白。转录因子GATA-4作为锌指蛋白转录因子，含2个转录激活结构域、2个锌指结构域和1个核定位信号结构域[16,17]。锌指结构域负责与靶基因 DNA 结合，该结合结构[Cys-X2-Cys-X17-Cys-X2-Cys]（Cys为半胱氨酸，X为可变氨基酸）由两个毗邻的锌指构成，每一个锌指由两个Cys-X2-Cys结构组成，中间有17个氨基酸间隔。两个锌指功能不同：C末端锌指在GATA家族中高度保守，是识别与结合 DNA一致序列所必须的；N末端锌指自身并不能结合DNA，但却能影响GATA-4与靶DNA结合的稳定性和特异性，影响GATA-4转录因子的转录活性[16,17]。

近年来的研究发现，GATA-4与AF的发生有关。Jiang等[18]对160例无血缘关系的孤立性AF患者的GATA-4基因进行测序分析，发现了两个新的杂合错义突变p.G16C和p.H28D，功能分析显示，上述两个突变均可显著降低GATA-4的转录活性，提示GATA-4突变所致单倍体效率不足或显性抑制作用为AF发生的病理基础。Yang等[19-22]认为，GATA-4基因突变所致的AF可能与心肌袖的发育异常、GATA4下游基因表达水平的降低有关。目前已有较多研究证实，肺静脉心肌袖参与了AF的触发和维持，其电生理机制主要包括局灶触发和折返激动。基于该理论，环肺静脉射频消融术已经成为临床治疗 AF 的有效方法[23,24]。进一步研究发现，心肌袖的形成受包括NKX2-5和GATA-4在内的多种转录因子的协同调节。在胚胎发育期间，NKX2-5基因表达于心房肌、心室肌、房室传导系统和肺静脉肌袖，并且与窦房结的局限化有关。当NKX2-5基因表达减少时，肺静脉肌袖可表现出起搏活性，呈窦房结样表型[25-27]。GATA-4作为NKX2-5的协同转录激活作用伙伴，其突变可能通过降低NKX2-5靶基因的表达水平，促使肺静脉肌袖的工作心肌表型转变为窦房结样表型，最终导致AF[19-22]。总之，GATA-4基因在心血管系统的发育、成熟和重构中具有重要作用，该基因突变可导致AF。对GATA-4所致AF作用的深入研究将有助于进一步揭示AF的分子机制，为AF的早期预防和基因特异性治疗奠定基础。这些突变是否有地区差异，有待于进一步探索研究。

本研究对上海崇明地区100例孤立性房颤患者GATA-4基因外显子编码序列进行检测，1例孤立性房颤患者GATA-4基因发现杂合同义突变p.His28His，2例孤立性房颤患者识别出p.Ala33Ala杂合同义突变；3例孤立性房颤患者GATA-4基因携带p.Ala240Thr杂合错义突变，8例孤立性房颤患者携带p.Asn 349 Ser杂合错义突变。其中p.Ala 240Thr及p.Asn 349 Ser突变位点为首次报道，p.Ala240Thr位于N末端锌指结构，推测突变导致GATA-4与靶DNA结合的稳定性和特异性下降，GATA4转录因子的转录活性降低，造成NKX2-5靶基因的表达减少，促使肺静脉肌袖的工作心肌表型转变为窦房结样表型，最终导致房颤发生。

本研究的样本量较小，且缺乏进一步的功能分析，这些都需要在将来的工作中进一步完善。AF的发病有多基因的参与，发病机制复杂。研究候选基因可能对明确AF的遗传学机制有更大帮助，为最终攻克AF基因治疗打下重要基础。