M1 型巨噬细胞对慢性牙周炎模型小鼠免疫状态的影响

籍 辰, 张文娟, 关 宁, 高秀秋, 王琳源

（1.锦州医科大学附属第二医院牙周黏膜科，辽宁 锦州 121000；2.锦州医科大学附属第一医院脑与脊髓损伤重点实验室，辽宁 锦州 121000）

慢性牙周炎是由牙周致病菌引起的、发生在牙齿支持组织（包括牙龈、牙周膜、牙槽骨） 的炎症性、破坏性疾病，牙周炎的病因复杂，包括感染因素（细菌、病毒） 和非感染因素（机体免疫的状态、遗传因素等）。目前临床上治疗牙周炎常依赖于机械性地去除牙菌斑，如洁治、刮治和牙周手术等，但因牙周炎患者的病程较长，一旦患者牙周维护不佳，则易出现牙周病损进行性加重。因此，研究慢性牙周炎发生发展的相关机制，寻找关键的阻断靶点是目前亟需解决的问题。研究［1］表明：宿主对抗牙周致病菌的免疫应答（包括固有免疫和适应性免疫） 在牙周炎的发生发展和转归中发挥重要作用。研究［2］显示：在牙周炎的病变牙周组织中巨噬细胞浸润增多，巨噬细胞作为宿主先天免疫系统的重要组成部分，能够分泌单核细胞趋化蛋白1（monocyte chemotactic protein 1，MCP-1）、白细胞介 素8 （interleukin-8， IL-8） 和 白 细 胞 介 素6（interleukin-6，IL-6） 等趋化因子，从而诱导更多的巨噬细胞在牙周组织中活化聚集，通过趋化因子产生和自我调节，建立防御机制。巨噬细胞具有很强的可塑性，可极化为不同类型，其中，M1 型巨噬细胞作为巨噬细胞的一种亚型，具有黏附和杀伤细菌、分泌大量促炎因子及启动获得性免疫应答的作用［3］，可抑制巨噬细胞向M1 型巨噬细胞分化，明显抑制炎症反应。国内外尚无有关M1 型巨噬细胞对慢性牙周炎免疫状态影响的研究报道。本实验以牙龈卟啉单胞菌诱导的牙周炎小鼠［4-5］为研究对象，评价小鼠牙槽骨的吸收情况，采用HE 染色观察小鼠牙周组织改变， 流式细胞术和实时定量PCR 法检测M1 型巨噬细胞及其相关因子诱导型一氧 化 氮 合 酶 （induced nitric oxide synthase，iNOS） 在慢性牙周炎小鼠病损组织中的表达情况，探讨M1 型巨噬细胞在慢性牙周炎中的作用，为牙周炎的防治提供免疫理论基础和实验依据。

1 材料与方法

1.1实验动物、主要试剂和仪器SPF 级7 周龄C57BL/6 雌性小鼠10 只， 体质量18～20 g， 由辽宁长生生物技术股份有限公司提供，动物生产许可证号：SCXK （辽） 2015-0001，动物实验过程经锦州医科大学伦理委员会批准。小鼠牙列完整，无龋坏及牙周疾病，于室内采光条件良好、清洁安静、通风良好、室温22 ℃、光照周期12 h∶12 h、无特殊致病菌的环境中给予无菌饲料分笼喂养。Ficoll分离液（天津灏洋生物制品科技有限责任公司），F4/80 抗体（美国Biolegend 公司）， iNOS 抗体（美国eBioscience 公司）， 反转录试剂盒（中国Vazyme 公 司）， TRIzol （中 国Ambion 公 司），iNOS 引物合成、β-actin 引物合成和DEPC 水（中国鼎国昌盛公司）。 流式细胞仪和FACS Calibur（美国BD 公司），实时定量PCR 仪和高速低温冷冻离心机（美国Thermo 公司），体视显微镜（日本Olympus 公司），厌氧培养箱（日本SANYO 公司），涡旋混合器（江苏海门市其林贝尔仪器制造厂），微量加样器（法国吉尔森公司）。

1.2动物分组和处理10 只小鼠随机分为对照组和慢性牙周炎组，每组5 只。慢性牙周炎组：牙龈卟啉单胞菌W83以菌密度1×1010mL－1重悬于含2% 羧甲基纤维素钠（carboxymethyl cellulose sodium， CMC） 的 磷 酸 盐 缓 冲 液（phosphate buffer sulution，PBS） 中。将100μL 菌悬液涂抹于小鼠龈缘乃至整个口腔，连续涂抹7 d。对照组：以相同体积含2% CMC 的PBS 液涂抹于小鼠口腔。第35 天出现明显的牙槽骨吸收，说明小鼠牙周炎动物模型成功建立。于口腔涂抹结束后处死小鼠。

1.3 2组小鼠牙槽骨吸收情况评价处死小鼠后，截取上颌骨，去除软组织，在体视显微镜下测量上颌磨牙（ 第一至第三磨牙） 从釉牙骨质界（cementoenamel junction， CEJ） 到 牙 槽 嵴 顶（alveolar bone crest， ABC） 的距离， 每个牙测量颊、腭侧共4 个位点：颊、腭侧的近远中位点，取12 个位点的平均值。2 组小鼠进行比较，判断牙槽骨吸收程度。

1.4HE 染色观察2组小鼠牙周组织形态表现取2 组小鼠半侧上颌骨的磨牙段，经固定、脱钙、脱水、包埋，制成近远中向5μm 切片，常规HE 染色观察牙龈卟啉单胞菌对牙周组织炎症的影响。

1.5流式细胞术分析2组小鼠牙龈组织中M1型巨噬细胞百分率和细胞数①组织样本制备：分别取对照组小鼠和慢性牙周炎组小鼠牙龈， 参考KOBAYASHI 等［6］方 法 制 备 牙 龈 单 细 胞 悬 液 制 备单核细胞悬液，牙龈组织置于1 mL PBS 液中切成1 mm×1 mm×1 mm 小块，取上清，经胶原酶消化的牙龈细胞中的单个核细胞再由Ficoll 分离液分离。②细胞染色和检测：将牙龈细胞悬液分别加入流式管并根据组别编号。F4/80 抗体和iNOS 抗体行胞外胞内因子染色，室温避光孵育，PBS 洗涤重悬，采用流式细胞仪检测牙龈组织中M1 型巨噬细胞的表达情况。采用FlowJo10.4 软件分析巨噬细胞和M1 型巨噬细胞的百分率，在1×104个牙龈单个核细胞内分析F4/80＋iNOS＋M1 型巨噬细胞数。

1.6实时定量PCR法检测2组小鼠牙龈组织中M1型巨噬细胞相关因子iNOS mRNA表达水平采用TRIzol 试剂常规提取小鼠牙龈组织总RNA，并经紫外分光光度仪检测纯度， 于260 和280 nm 处检测RNA 吸光度A （260） 值，以A （260）/A （280）的比值为1.8～2.2 作为实验样本。 操作完成后，冻存于－80℃冰箱或直接进行PCR 反应。按逆转录试剂盒说明书将总RNA 逆转录为cDNA 进行扩增，实时定量PCR 反应的总体系为20 μL。引物设计，iNOS 上游引物序列 5′- ACAGGAGAAAGCGCAAAAC -3′，下游引物序列 5′-TGTGGCCTTGTGGTGAAGAG-3′； 以β -actin 为 内 参 照 物，β-actin 上游引物序列5′- GGCTGTATTCCCCTCCATCG-3′，下游引物序列5′-CCAGTTGGTAACAATGCCATGT-3′。引物均由北京鼎国昌盛生物科技有限公司合成。 反应条件： 预变性95 ℃、30 s；循环反应95 ℃、5 s；60 ℃、30 s，共40 个循环； 溶解曲线95 ℃、 15 s、 60 ℃、 1 min、 95 ℃、15 s。每个样本做3 个平行孔，结果采用2－ΔΔCt法进行计算。

1.7统计学分析采用SPSS 22.0 和GraphPad Prism 8.0 统计软件对数据进行统计学分析。2 组小鼠CEJ 到ABC 距离、牙龈组织中巨噬细胞和M1 型巨噬细胞的细胞百分率和细胞数、 牙龈组织中iNOS mRNA 表达水平以x±s表示，组间样本均数比较采用两独立样本t检验。以P＜0.05 为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 2组小鼠牙槽骨吸收情况对照组和慢性牙周炎组小鼠CEJ 到ABC 的距离分别为（134.033±19.523） μm 和（206.5 ±20.797） μm。与对照组比较，慢性牙周炎组小鼠发生明显的牙槽骨吸收，ABC 高度降低， CEJ 到ABC 的距离增大（P＜0.01）。体视显微镜下观察的2 组小鼠牙槽骨吸收情况见图1 （插页二）。

2.2 2组小鼠牙周组织形态表现对照组小鼠结合上皮完整并附着于釉牙骨质界，牙周膜胶原纤维排列整齐，牙槽骨表面完整，未见破骨细胞和骨吸收陷窝形成。慢性牙周炎组小鼠结合上皮上方与牙面分离，附着位于CEJ 的根方，牙周膜胶原纤维溶解、变性，排列紊乱，结合上皮周围有大量的炎细胞浸润，ABC 吸收变平，可见破骨细胞和骨吸陷窝形成。见图2 （插页二）。

2.3 2组小鼠牙龈组织中F4/80＋iNOS＋M1 型巨噬细胞百分率

对照组小鼠牙龈组织中F4/80＋巨噬细胞细胞百分率为（10.236±0.982） %，慢性牙周炎小鼠牙龈组织中F4/80＋巨噬细胞细胞百分率为（29.940±1.745） %，与对照组比较，慢性牙周炎小鼠牙龈组织中F4/80＋巨噬细胞细胞百分率明显升高（P＜0.01）。 对照组小鼠牙龈组织中F4/80＋iNOS＋M1 型 巨 噬 细 胞 百 分 率 为（5.408±0.754） %， 慢性牙周炎组小鼠牙龈组织中F4/80＋iNOS＋M1 型 巨 噬 细 胞 百 分 率 为（30.580±1.522） %；在1×104个牙龈单细胞中，对照组小鼠牙龈组织中M1 型巨噬细胞数为（56.078±13.645） 个，慢性牙周炎组小鼠牙龈组织中M1 型巨噬细胞数为（917.738±97.383） 个。与对照组比较，慢性牙周炎组小鼠牙龈组织中M1 型巨噬细胞百分率和细胞数均有明显升高（P＜0.01）。见图3。

图3 流式细胞术检测2 组小鼠牙龈组织中F4/80＋巨噬细胞和F4/80＋iNOS＋M1 型巨噬细胞的百分率Fig.3 Percentages of F4/80＋macrophages and F4/80＋iNOS＋M1 macrophages in gingival tissue of mice in two groups detected by flow cytometry

2.4 2组小鼠牙龈组织中M1型巨噬细胞相关因子iNOS mRNA表达水平对照组和慢性牙周炎小鼠牙龈组织中iNOS mRNA 均有不同程度的表达；慢性牙周炎组小鼠牙龈组织中iNOS mRNA 表达水平（1.212±0.133） 高 于 对 照 组（1.985±0.181）（P＜0.01）。

3 讨 论

牙周病是人类口腔两大类疾病之一，其患病率和严重性随年龄增高而增加。慢性牙周炎是牙周病中重最为常见的一类疾病，其不仅是目前我国成人牙齿缺失的主要原因，影响口腔局部健康，而且与某些系统性疾病如心血管疾病、消化系统疾病等有着双向联系，进而影响全身健康［7］。由于牙周组织样本取材有限，利用稳定可靠的牙周炎实验动物模型研究慢性牙周炎的病因和发病机制对该疾病的预防及治疗具有重要意义。小鼠牙周组织结构与人类相似，并且其口腔中不含有慢性牙周炎的最主要的致病菌——牙龈卟啉单胞菌，因此，利用小鼠模型是研究慢性牙周炎宿主免疫和炎症反应的重要手段［8］。本研究以牙龈卟啉单胞菌悬液连续7 d 涂抹小鼠口腔，第35 天出现明显的牙槽骨吸收，成功建立小鼠牙周炎动物模型。

研究［9］已证明：在慢性牙周炎的发病过程中，宿主对抗牙周致病菌产生的免疫反应与致病菌之间的相互作用影响着牙周炎的炎症进程和组织破坏。牙龈卟啉单胞菌等牙周致病菌定植到龈沟后，牙龈上皮细胞表面的模式识别受体如Toll 样受体，识别牙周致病菌并产生细胞因子IL-8 和肿瘤坏死因子（tumor necrosis factor， TNF） 等， 表达趋化因子如Toll 样受体等，激活并招募局部牙周组织中的免疫细胞如中性多形核白细胞、单核/巨噬细胞等至细菌定植区控制并清除致病菌［10-11］。巨噬细胞作为固有免疫应答的重要组成部分，在外来病原体和趋化因子的作用下，具有启动固有免疫应答，加工和递呈抗原，吞噬杀灭病原菌及清除细胞碎片等多种功能，对维持体内的内稳态平衡和宿主防御有重要 意 义［12］。 研 究［13-14］显 示： 类 风 湿 关 节 炎（rheumatoid arthritis ，RA）、实验性自身免疫性脑脊 髓 炎 （experimentalautoimmune encephalomyelitis， EAE） 和 炎 症 性 肠 病（inflammatory bowel disease，IBD） 等炎症性病损组织中巨噬细胞浸润增多，表明巨噬细胞参与机体抗细菌性感染以及免疫性炎症病损。JAGANNATHAN 等［15］发现：慢性牙周炎患者牙龈组织中CD14＋CD16＋单核/巨噬细胞百分率升高。LAM 等［16］发 现：应 用 双 磷 酸 盐-脂 质 体 清 除 巨 噬细胞，牙龈卟啉单胞菌诱导牙周炎小鼠的牙周骨吸收加重，与以往研究［17］结果一致。本研究结果显示：牙周炎小鼠病损牙龈组织中F4/80＋巨噬细胞百分率升高，进一步证明巨噬细胞在牙周组织抵抗牙周致病菌侵入的过程中发挥重要作用。

巨噬细胞具有高度可塑性，在微生物产物、受损细胞、活化的淋巴细胞和炎细胞刺激下活化并极化为细胞亚群，这些细胞亚群通过表达各自的表面分子、分泌细胞因子和趋化因子在组织局部发挥不同 作 用［18］。 巨 噬 细 胞 在 脂 多 糖（lipopolysaccharide，LPS） 和IFN-γ 的刺激下诱导极化为M1 型巨噬细胞，M1 型巨噬细胞分泌炎性细 胞 因 子 如TNF-α、 IL-1β、 IL-6 和IL-23 等［19］，合成分泌iNOS 进而催化L-精氨酸产生NO 和L-瓜氨酸， 通过表达趋化因子CCL2-4、 CXCL8-11 招募Th1 细胞至组织进而增强宿主的促炎效应［20-21］。 在实验性自身免疫性脑脊髓炎早期阶段，M1 型巨噬细胞活化并释放促炎性细胞因子，损伤中枢神经系统［17］。JONES 等［22］在体外研究发现：牙龈卟啉单胞菌可通过细胞壁的LPS 激活巨噬细胞向M1 型巨噬细胞极化，分泌大量的促炎性细胞因子IL-1、IL-6和趋化因子MCP-1。GONZALEZ等［23］在牙周炎恒河猴牙龈组织中发现：M1 型巨噬细胞相关因子CCL13、CCL19、CCR7 和TLR4 水平明显升高。本研究结果显示：正常小鼠牙龈和牙周炎的病损牙龈组织中均存在M1 型巨噬细胞，并且牙周炎小鼠M1 型巨噬细胞比例和数量均明显增多，相关细胞因子iNOS 表达上调， 表明牙周炎小鼠M1 型巨噬细胞介导的免疫应答增强，提示在正常情况下，牙龈组织中M1 型巨噬细胞能有效清除病原刺激从而保护牙龈组织处于健康的状态，而在发生牙周炎中，随着入侵病原刺激物增多，大量的炎性因子促进M1 型巨噬细胞活化并分泌促炎性细胞因子，从而形成放大效应，使机体对抗牙周致病菌的反应过强，从而加重了牙周组织的炎症和组织损伤。

本研究通过分析小鼠牙龈组织中M1 型巨噬细胞以及相关细胞因子的表达情况表明：牙周炎小鼠M1 型巨噬细胞介导的免疫应答增强，提示作为机体抗牙周致病菌的前沿，M1 型巨噬细胞介导的适度的免疫应答对牙周组织发挥保护性作用，而过强的反应则会促进牙周炎症进展。在牙周微环境中，M1 型巨噬细胞的活化及功能发挥受多种因子的调节，如何调控M1 型巨噬细胞免疫反应强度，使其发挥有效的防御作用仍需进一步研究。