虎杖苷对实验性哮喘小鼠气道炎症的影响及其机制

朴玉华, 王知广, 朴艺花, 姜京植, 王重阳, 徐 畅, 李良昌, 延光海, 朴红梅

（1.延边大学附属医院呼吸内科，吉林 延吉133002；2.延边大学医学院解剖学教研室吉林省过敏性疾病重点实验室，吉林 延吉 133002）

哮喘为慢性气道炎症性疾病，其中Th1 / Th2细胞因子的表达失衡在哮喘发病机制中发挥重要作用。 Th2 细胞因子白细胞介素4 （interleukin-4，IL-4）、白细胞介素5 （interleukin-5，IL-5） 和白细胞介素13 （interleukin-13， IL-13） 参与哮喘炎症反应，并介导免疫球蛋白E （IgE） 的产生，引起血液和肺组织中嗜酸性粒细胞的聚集，导致黏液分泌增多和气道高反应性以及气道重塑等［1］。目前减轻炎症反应仍然是治疗哮喘的有效方法。沉默信息调 节 因 子 1 （silent information regulator of transcription 1，SIRT1） 也称为NAD+依赖性脱乙酰基酶sirtuin-1， 是sirtuin 蛋白家族成员之一。SIRT1 已被证实能介导多种细胞事件， 对炎症、衰老和抗肿瘤等多方面有一定调控作用［2］。核因子κB （nuclear factor-kappaB， NF-κB） 是炎症反应中重要的调节靶点，可被典型和非典型信号通路激活。过敏原和促炎细胞因子等可以激活NF-κB，并加重哮喘的炎症反应［3］。研究［4-5］证明：SIRT1可以调节哮喘中炎症因子的表达， 并通过调控NF- κB 乙酰化水平介导炎症的发生发展。 因此，SIRT1 可能是参与哮喘炎症调控的重要靶点。

虎杖苷（polydatin， PD） 是植物虎杖的提取物，是一味天然创新药物，具有广泛的药理作用，包括抗炎、抗肿瘤、抗凋亡和氧化应激等，并且参与炎症相关的全身组织器质性疾病，如肺恶性肿瘤、急性肾损伤及化脓性脑膜炎等疾病的发生发展［6-8］。研究［9］显示：PD 能够上 调SIRT 1 蛋白的表达，增加巨噬细胞增殖，降低氧化低密度脂蛋白（oxidized low density lipoprotein，Ox-LDL） 诱导的细胞内活性氧（reactive oxygen species，ROS） 水平， 抑 制 炎 症 细 胞 因 子 的 表 达。 YE 等［10］发 现：PD 可以直接抑制lyn 和syk 激酶活性，下调丝裂原活化蛋白激酶（mitogen-activated protein kinase，MAPK）、磷脂酰肌醇3-激酶（phosphatidylinositol 3-kinase， PI3K） /蛋白激酶B （protein kinase B，AKT） 和NF-κB 信号通路，抑制肥大细胞脱颗粒，从而减轻哮喘气道炎症。目前尚无PD 在哮喘模型中对SIRT 1／NF-κB 通路影响的研究报道。本研究探讨PD 对卵清蛋白（ovalbumin， OVA） 诱导哮喘模型的治疗作用及其对SIRT 1／NF-κB 通路的影响。

1 材料与方法

1.1实验动物50 只6 周龄雌性BALB/c 小鼠，清洁级， 购自延边大学实验动物中心， 体质量（20 ±2） g， 动物生产许可证号： SCXK （吉）2017-0003。本研究获得延边大学医学院伦理委员会的批准，所有实验环节严格遵照《实验动物管理条例》 进行操作。

1.2药物、主要试剂和仪器PD 购自上海纯优生物有限公司。 OVA 、 Al （ OH）3粉和乙酰化NF- κB p65 （3045S） 购 自 美 国Cell Signaling Technology 公 司， SIRT1 抗 体（TA336801） 和β -actin 抗体（TA-09） 购自北京中杉金桥公司，免疫组织化学试剂盒、DAB 试剂盒、IL-4、IL-5 和IL- 13 ELISA 试剂盒购自赛默飞世尔科技公司。2135 型轮转式切片机购自德国徕卡公司，雾化吸入器购自大连医疗器械厂U- 219，Western blotting转膜仪购自美国Bio-Rad 公司， 酶联免疫检测仪（ 型 号RT-2100C） 购 自 美 国RAY- TO 公 司，5415D 型低温高速多功能离心机购自美国Eppendorf 公司，Amersham Imager 6 00 凝胶成像仪购自美国GE Healthcare 公司。

1.3动物分组和模型制备50 只雌性BALB/c 小鼠随机分为对照组，OVA 模型组，低、中和高剂量PD 组（PD 剂量为15、30 和45 mg·kg－1）；每组10 只。所有小鼠适应性饲养1 周，于饲养第1、7和14 天对照组小鼠腹腔注射0.2 mL 生理盐水，其余4 组小鼠采 用0.2 mL 混合 液［10 μ g OVA 和1 mg Al （ OH）3］ 腹腔注射致敏。 第21 天起，低、中和高剂量PD 组小鼠分别腹腔注射15、30 和45 mg·kg－1PD 治 疗 液0.2 mL ， 每 天1 次， 连 续7 d，对照组和OVA 组小鼠以0.2 mL 生理盐水代替（激发前1 h 给药）。 第21 天起给药1 h 后，OVA 组和各剂量PD 组小鼠连续采用激发液（含3% OVA 10 mL） 雾化激发7 d，每次30 min，对照组小鼠采用生理盐水代替。在激发过程中模型组小鼠出现烦躁、打喷嚏、挠腮和呼吸急促等表现，视为造模成功。

1.4标本采集最后一次致敏24 h 后麻醉小鼠，并固定于手术板上，纵行切开颈部皮肤，逐层剥离暴露气管，气管切一小口插入细管，缓慢注入4 ℃生理盐水1 mL后回抽3次，回抽量不得少于0.8 mL。收集的支气管肺泡灌洗液（bronchoalveolar lavage fluid，BALF） 以3 000 r·min－1离心5 min。收集上清液置于－80 °C 冻存，采用离心后的沉淀物制作涂片。最后取出小鼠左肺组织置于甲醛溶液中固定，右肺组织置于－80°C 条件下保存。

1.5各组小鼠肺组织形态表现检测各组小鼠左肺组织置于甲醛溶液中固定后，按浓度梯度依次进行脱水、浸蜡包埋等过程， 并将蜡块切成厚度为4 μm 的切片，分次进行HE 和PAS 染色。镜下观察各组小鼠肺组织形态表现。

1.6各组小鼠BALF中细胞总数、嗜酸性粒细胞、中性粒细胞和淋巴细胞数检测BALF 沉淀物经离心后加入生理盐水定容至0.2 mL，混匀后置入细胞涂片离心机离心。Diff-Quick 染色后，在镜下观察细胞总数及嗜酸性粒细胞、中性粒细胞和淋巴细胞数。

1.7各组小 鼠BALF中IL-4、IL-5和IL-13水平检测收集小鼠BALF， 按ELISA 试剂盒说明书步骤检测BALF 中IL-4、 IL-5 和IL-13 水平，单位以ng·L－1表示。

1.8免疫组织化学法检测各组小鼠肺组织中SIRT1和NF-κB p65蛋白表达肺组织切片经过熔蜡、二甲苯脱蜡和乙醇脱水后，在抗体修复液中孵化15 min。采用SIRT1、NF-κB p65 一抗和对应二抗孵化。 DAB 着色， 苏木精复染， 脱水和固定、封片，镜下观察。

1.9 Western blotting法检测各组小鼠肺组织中SIRT1和乙酰化NF-κB p65蛋白表达水平提取各组小鼠右肺组织蛋白并检测蛋白乙酰化水平。 将等 量 蛋 白 （20 μg） 在10% SDS-PAGE 中以70～90 V 电压进行电泳。然后在300 mA 、4℃条件下转膜，在脱脂奶粉封闭液中封闭1 h。分别采用乙酰化NF-κB p65 和SIRT1 抗体4℃孵育过夜。采用TBST 充分洗膜，在对应二抗溶液中常温摇床孵育1 h。 洗 涤3 次 后， 采 用ECL 试 剂 曝 光， 采 用Amersham Imager 600 软件分析目的条带灰度值，计算目的蛋白表达水平。目的蛋白表达水平= 目的蛋白条带灰度值/ β-actin 条带灰度值。

1.10统计学分析采用SPSS 25.0 统计软件进行统计学分析。各组小鼠BALF 中细胞总数、嗜酸性粒细胞、中性粒细胞和淋巴细胞数及IL-4、IL-5、IL-13 水平，肺组织中SIRT1 和乙酰化NF-κB p65蛋白表达水平均符合正态分布，以x±s表示，组间比较采用单因素方差分析，组内两两比较采用LSD 法。以P＜0.05 为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1各组小鼠肺组织形态表现与对照组比较，OVA 组小鼠可见气管壁增厚，气道和血管周围大量炎症细胞浸润，各剂量PD 组小鼠经过治疗后上述表现得到明显改善。与对照组比较，OVA 组小鼠可见黏液分泌增多和杯状细胞明显增生； 与OVA 组比较，各剂量PD 组小鼠杯状细胞增生和黏液分泌明显减少。见图1 （插页一）。

2.2各组小鼠BALF中细胞总数、嗜酸性粒细胞、中性粒细胞和淋巴细胞数OVA 组小鼠BALF 中细胞总数、嗜酸性粒细胞、中性粒细胞和淋巴细胞数明显高于对照组（P＜0.05）。与OVA 组比较，中和高剂量PD 组小鼠BALF 中细胞总数、嗜酸性粒细胞、中性粒细胞和淋巴细胞数明显减少（P＜0.05），低剂量PD 组小鼠BALF 中细胞总数、嗜酸性粒细胞、中性粒细胞和淋巴细胞数虽有下降趋势，但差异无统计学意义（P＞0.05）。见图2。

图2 各组小鼠BALF 中炎症细胞数Fig.2 Number of inflammatory cells in BALF of mice in various groups

2.3各组小鼠BALF中IL-4、IL-5和IL-13水平与对照组比较，OVA 组小鼠BALF 中IL-4、IL-5和IL-13 水平明显升高（P＜0.05）。与OVA 组比较，中和高剂量PD 组小鼠BALF 中IL-4、 IL-5 和IL-13 水 平 降 低（P＜0.05）， 低 剂 量PD 组 小 鼠BALF 中IL-4、 IL-5 和IL-13 水平虽有下降趋势，但差异无统计学意义（P＞0.05）。见图3。

2.4各组小鼠肺组织中SIRT1和NF-kB p65蛋白表达情况与对照组比较，OVA 组小鼠气道周围可见棕黄色颗粒状的SIRT1 和NF-κB p65 聚集较为明显。与OVA 组比较，各剂量PD 组小鼠气道周围SIRT1 的聚集逐渐增多，而NF-κB p65 的聚集逐渐减少。见图4 （插页一）。

图3 各组小鼠BALF 中细胞因子水平Fig.3 Levels of cytokines in BALF of mice in various groups

2.5各组小鼠肺组织中SIRT1和乙酰化NF-κB p65蛋白表达水平OVA 组小鼠肺组织中SIRT1和乙酰化NF-κB p65 蛋白表达水平较对照组明显升高（P＜0.05）。 与OVA 组比较， 中和高剂量PD 组小鼠肺组织中SIRT1 蛋白表达水平升高（P＜0.05）。与OVA 组比较，低剂量PD 组小鼠肺组织中SIRT 1 蛋白表达水平差异无统计学意义（P＞0.05）。与OVA 组比较，中和高剂量PD 组小鼠肺组织中乙酰化NF-κB p65 蛋白表达水平降低（P＜0.05）；与OVA 组比较，低剂量PD 组小鼠肺组织中乙酰化NF-κB p65 蛋白表达水平差异无统计学意义（P＞0.05）。见图5 和图6。

3 讨 论

哮喘是一个全球性的健康问题，其患病率在全球范围内逐渐增多，据统计2015 年哮喘患者已达到约3.582 亿人，并影响着不同年龄段的人群［11］。气道炎症是哮喘的本质特征，通常被认为是由Th2细胞因子IL-4、IL-5 和IL-13 所介导，并导致杯状细胞增生、 支气管收缩和气道嗜酸性粒细胞增多［12-13］。本研究结果显示：PD 对哮喘小鼠肺内炎症细胞渗出、黏液分泌增多和杯状细胞增生有明显的抑制作用。同时，PD 能有效抑制小鼠BALF 中细胞总数、嗜酸性粒细胞、中性粒细胞和淋巴细胞数以及IL-4、IL-5 和IL-13 等促炎因子的表达，表明PD 对OVA 诱导的哮喘小鼠气道炎症有一定的抑制作用。

图5 各组小鼠肺组织中SIRT 1 蛋白表达情况Fig.5 Expressions of SIRT1 protein in lung tissue of mice in various groups

SIRT1 是sirtuin 蛋白质家族的一员，是酿酒酵母sir2 基 因 的 同 源 物。研 究［14］显 示：SIRT1 参 与代谢相关疾病、自身免疫性疾病、心肌病、神经系统疾病和肿瘤的发生发展。研究［15］显示：SIRT 1不仅具有抗炎、调节代谢平衡和自噬、抗凋亡和抗氧化应激等功能，而且能够通过调节组蛋白和转录因 子NF- κ B、 缺 氧 诱 导 因 子（hypoxia-inducible factor，HIF） -1α 的去乙酰化抑制炎症。NF-κB 是炎症相关的主要调节因子， 由RelA/p65、 c-Rel、RelB、 p50 （NF- κB 1） 和p52 （NF- κB 2） 等5 种蛋白质组成。NF-κB 是参与广泛炎症反应中调控细胞因子活性的重要角色，通过其翻译后修饰调节炎症，包括RelA / p65 的乙酰化、泛素化和磷酸化等。RelA / p65 的转录活性需要Lys310的乙酰化，而SIRT 1 可 以 使Lys310去 乙 酰 化［16-17］。研 究［18］表明：黄连素通过上调SIRT1 的表达，减弱NF-κB p65 的乙酰化，抑制促炎因子的的产生而发挥抗炎特 性。 YU 等［19］研 究 显 示： 黄 芩 苷 通 过 调 节SIRT1／NF-κ B 通路使促炎细胞因子水平降低，SIRT1 可能是通过抑制NF-κB 活化而发挥调节炎症的关键作用。

图6 各组小鼠肺组织中NF-κB p65 蛋白表达情况Fig.6 Expressions of NF -κB p65 protein in lung tissue of mice in various groups

PD 是白藜芦醇的天然前体，是白藜芦醇与葡萄糖结合的产物，而且其具有相似的药理作用。研究［20］ 显示：白藜芦醇作为SIRT1 的激活剂，通过促进RelA / p65 Lys310去乙酰化而抑制NF-κB 的信号传导。研究［21］证明：PD 通过SIRT／NF-κB 通路抑制烧伤小鼠早期常损伤的炎症反应。研究［22］表明： PD 能通过增加SIRT1 的表达及下调NF- κB p65 的 移 位、 IκBα 的 降 解 以 及NLRP3、ASC 和caspase-1 蛋白等炎症组分水平，抑制血清和肾脏中促炎细胞因子的产生，从而起到保护肾功能的作用。本研究结果显示：PD 能抑制哮喘小鼠气道炎症，能促进小鼠肺组织中SIRT1 蛋白表达，抑制NF-κB p65 蛋白表达，降低NF-κB p65 的乙酰化水平。上述实验结果表明：PD 能抑制哮喘的气道炎症反应，且可能通过SIRT／NF-κB 信号通路发挥作用，但具体作用机制需要进一步研究。

综上所述，PD 能减轻气道周围炎症细胞浸润和杯状细胞增生，抑制Th2 细胞相关促炎因子的表达，并促进SIRT1 蛋白及抑制NF-κB p65 表达，从而缓解哮喘小鼠气道炎症。因此SIRT1／NF-κB 信号通路可能是PD 抑制哮喘气道炎症的作用机制之一。