针药并用诱导自噬对ApoE 基因敲除小鼠认知功能的影响

吕美娟, 马贤德, 任 路

（1.辽宁中医药大学针灸推拿学院，辽宁 沈阳110032; 2.辽宁中医药大学教学实验中心，辽宁 沈阳 110032；3.辽宁中医药大学研究生院，辽宁 沈阳 110032）

阿尔茨海默病（Alzheimer’ s disease， AD）是记忆障碍最常见的神经退行性疾病［1］，通常与行为变化有关，常表现为焦虑、幻觉、妄想、冷漠和异常运动等行为［2］。随着老年人口比例的持续增长，AD 的患病率进一步升高，世界老年痴呆症报告（2015 年）［3］指出：到2030 年，AD 患者将达到1 600 多万，到2050 年将达到2 800 万。AD 的病理特征是β-淀粉样蛋白（amyloid β-protein，Aβ） 沉积过多和含有高磷酸化Tau （p-Tau） 的神经纤维内缠结［4-6］。Aβ 和p-Tau 的异常积累提示疾病过程中蛋白质处理系统失效。事实上，蛋白质稳态的失衡（包括自噬途径） 与AD 的发病机制有关联［7-8］。中医中药和针灸对AD 均具有较好的作用。研究［9］表明：单一应用中药或针刺治疗AD 具有良好的疗效。目前，有关针药并用的研究相对较少，且作用机制不明确。本研究以ApoE 基因敲除小鼠作为研究对象，观察化痰祛瘀法针药并用对ApoE 基因敲除小鼠认知功能的影响，探讨其可能的作用机制。

1 材料与方法

1.1实验动物、实验药品、主要试剂和仪器选取50 只SPF 级8 周龄ApoE 基因敲除小鼠和10 只同龄具有相同遗传背景的C57BL/6J 小鼠，体质量18～22 g，所有小鼠均购于北京维通利华实验动物技术有限公司，动物生产许可证号：SCXK （京） 2012-0001，雌雄各半，分笼饲养。饲养于辽宁中医药大学SPF 级动物中心，自由摄食与饮水，饲养环境：温度22℃， 相对湿度40%～45%。 高脂饲料由胆固醇、蔗糖、蛋黄粉、猪油、胆盐和基础饲料等组成，由辽宁省沈阳市于洪区前民动物实验饲料厂加工制成。二陈汤和桃红四物汤购于辽宁中医药大学附属医院。全部药物加水浸泡1 h 后，先武火煎煮沸腾后调至文火煎煮，每份药物煎煮3 次，混合后浓缩为分别含 有 生 药 量 为 0.72 、 1.44 和2.89 g·L－1的煎剂，保存于4℃冰箱中备用。磷脂酰 肌 醇-3- 激 酶 （phosphatidylinositol-3-kinase，PI3K）、蛋白激酶B （protein kinase B，AKT） 和哺乳动物雷帕霉素靶蛋白（mamalian target of repamycin，mTOR） 一抗（美国Abcam 公司），β -actin 一抗、免疫组织化学SP 试剂盒和DAB 显色剂和辣根过氧化物酶标记的二抗（北京中杉金桥公司），苏木素、WB 和IP 细胞裂解液（上海碧云天公司）， ECL 超敏发光试剂盒（美国Thermo 公司）。 中研太和牌一次性使用无菌针灸针（0.25 mm×13.00 mm，北京健乐康医持器械有限公司），Morris 水迷宫由辽宁中医药大学重大科研平台动物行为学实验室提供， EPS300 型电泳仪（意大利SCOTSMAN 公司），VE-180 型电泳槽和VE-186 型转膜仪（上海天能公司），LX300 型微量离心机和TS-1000 水平摇床（江苏省海门市其林贝尔仪器制造有限公司），高速台式冷冻离心机（安徽嘉文仪器装备有限公司）， 数码显微镜（日本Olympus 公司），透射电镜（型号H-7650，日本日立公司）。

1.2实验分组和造模50 只8 周龄ApoE 基因敲除小鼠以高脂饲料喂养， 16 周后ApoE 基因敲除小鼠随机分为模型组、低剂量中药组、高剂量中药组、针药组和针刺组，每组10 只；10 只同龄C57BL/6L 小鼠以普通饲料喂养，作为对照组。ApoE 基因敲除小鼠继续给予高脂饲料喂养，同时施加干预因素；C57BL/6J 小鼠继续给予普通饲料喂养，不进行干预。

1.3各组小鼠给药方式从第17 周开始，低剂量中药组和高剂量中药组小鼠分别于单日给予含有生药 量 为0.72 和2.89 g·mL－1中 药 煎 剂 灌 胃， 每 次0.2 mL；双日以胶带固定于木板上，持续15 min。针药组小鼠单日给予含有生药量为1.44 g·mL－1（相当于中剂量中药组，各剂量组间给药剂量间距依据《药理实验方法学》，设定为彼此2 倍关系）中药煎剂灌胃，每次0.2 mL；同时双日以胶带固定于木板上，并予以针刺百会、关元和丰隆穴，每次针刺15 min 干预。针刺组小鼠单日经口灌胃蒸馏水0.2 mL； 双日以胶带固定， 并给予针刺干预，方法同针药组。模型组小鼠单日每只给予0.2 mL蒸馏水灌胃；双日以胶带固定于木板上， 持续15 min。对照组不进行处理。上述各组小鼠的干预方法共计持续8 周。

针刺取穴：采用胶带将小鼠固定于木板上，仰卧位，依照《常用实验动物穴位的标准化定位方法研究》［10］，选取百会、关元和丰隆穴。百会向后平刺2～3 mm， 关 元 穴 向 耻 骨 联 合 方 向45° 斜 刺1.5 mm，丰隆直刺3.0 mm。

1.4样本采集末次干预后1 h，采用水迷宫方法检测各组小鼠认知功能。水迷宫实验结束后，所有小鼠采用过量麻醉法处死，置于冰盘上，开颅取脑。将所取脑组织分为左脑和右脑，每组随机选取2 只小鼠左脑海马组织，切成1 mm×1 mm×1 mm组织块，固定于2.5% 戊二醛溶液中，用于电镜观察自噬体；剩余8 只小鼠的左脑浸泡于4% 多聚甲醛溶液中，用于免疫组织化学检测；从所有小鼠的右脑中分离海马组织， 置于1.5 mL 冻存管中，－ 80℃冰 箱 保 存， 用 于Western blotting 法检测。

1.5水迷宫实验检测各组小鼠逃避潜伏期采用Morris 水迷宫实验检测各组小鼠逃避潜伏期，评估小鼠空间学习和记忆能力。 将小鼠放置在充满水（21 ℃～22 ℃，通过添加奶粉使其不透明） 的圆形池（直径104 cm） 中的不同起始位置。 训练各组小鼠寻找平台（直径8 cm），该平台通过使用远距离视觉提示淹没在水面以下1 cm 处，并位于水池的西北象限中。 视觉提示出现在水池周围的四壁上，距离为0.5 m。 在所有实验中，视觉观察者均在房间中，并且始终位于同一位置（在围绕设备的窗帘后面）。连续5 d， 小鼠每天进行3 次采集试验（60 s 内小鼠爬上平台并停留≥5 s，则本次测试结束，所经历时间记作本次实验的逃避潜伏期。若在60 s 内小鼠未找到平台，则潜伏期记作60 s，并将小鼠放上平台，停留10 s，便于小鼠学习与适应。最后将小鼠擦拭干净置入鼠笼）。起始位置是随机选取除目标象限的任一象限，按照上述方法从入水象限顺时针方向（除目标平台所在象限以外） 依次对各象限进行记录，记录小鼠寻找平台的时间，即逃避潜伏期。

1.6各组小鼠海马组织的超微结构观察水迷宫实验结束之后，所有实验小鼠采用0.3% 戊巴比妥钠（30 mg·kg－1） 腹腔注射麻醉后将小鼠仰卧，四肢固定于手术台上，暴露胸腹部，常规消毒，开胸进行心尖快速灌注0.9% 氯化钠溶液，观察肝脏颜色至白色后停止灌注，在冰盘上开颅取脑。将所取脑组织分别按照电镜检测、 免疫组织化学和Western blotting 样本要求制备，然后置于－80℃冰箱保存待检。取每组5 只小鼠的海马组织切成1 mm×1 mm×1 mm 的组织中，置于含2.5%戊二醛的缓冲液（4 ℃、pH 7.4） 中固定4 h，经漂洗、脱水和浸透后，常规电镜包埋，超薄切片，片厚80 nm，每组每只小鼠海马组织切5 张切片，每张切片随机选取3～5 个视野。并在醋酸双氧铀及柠檬酸铅双重染色后，在透射电镜下观察自噬泡、自噬溶酶体和溶酶体的形态表现。

1.7 Western blotting法检测各组小鼠海马组织中PI3K、AKT和mTOR蛋白表达水平取出各组小鼠的海马组织，自然融化，于100 mg 海马组织加入1 mL 裂解缓冲液， 研磨均匀后静置30 min，4 ℃、1 2000 r·min－1离心15 min，取上清液。测定蛋白浓度，然后按1∶4 的比例加入5×SDS-PAGE蛋白上样缓冲液，混匀，100℃水浴锅加热5 min，充分变性蛋白。 SDS-PAGE 电泳， 转膜， 漂洗5 min，5% 脱脂奶粉室温封闭处理1 h。分别加入相应的抗体孵育（PI3K 稀释度为1∶400；AKT 稀释度为1∶500；mTOR 稀释度为1∶200），缓慢摇动，4 ℃孵育过夜。次日洗膜后， 加入二抗（1∶1 500）， 室 温 孵 育2 h。 加 入 洗 涤 液 TBST ，10 min×3 次。将PVDF 膜放置于凝胶成像分析系统中，避光配置ECL 发光液，并滴加在PVDF 膜上，反应1 min。采用凝胶成像分析系统自带分析软件测定条带的灰度值，以各目的蛋白与内参蛋白β-actin 条带灰度值的比值作为该蛋白表达水平。

1.8免疫组织化学法检测各组小鼠脑组织中PI3K、AKT和mTOR蛋白表达水平取多聚甲醛固定的各组小鼠脑组织，经自来水充分冲洗，常规脱水、浸蜡和包埋，制备石蜡块，然后以石蜡切片机将石蜡块进行冠状位连续切片，切片厚度5 μm，捞片后60 ℃烤片2 h， 常规脱蜡后， 进行抗原修复，采用免疫组织化学SP 法检测各组小鼠脑组织中PI3K、 Akt 和mTOR 的表达。 PI3K、 AKT 和mTOR 一抗稀释度为1∶300，4 ℃过夜；次日洗片后，孵育二抗工作液，室温下孵育60 min，PBS缓冲液洗片后，DAB 显色，苏木精复染，1% 盐酸乙醇分化，透明、脱水后中性树胶封片。检测吸光度（A） 值，并以A 值代表各蛋白表达水平。

1.9统计学分析采用SPSS 21.0 统计软件对数据进行统计学分析。各组小鼠逃避潜伏期和小鼠海马组织中PI3K、AKT 及mTOR 蛋白表达水平均呈正态分布，以±s表示，多组间样本均数比较采用单因素方差分析，组间两两比较采用SNK-q检验。以P＜0.05 为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1各组小鼠逃避潜伏期Morris 水迷宫定位航行实验中，随着学习天数的增加，每组小鼠逃避潜伏期均缩短。模型组小鼠逃避潜伏期均长于对照组（P＜0.05）；与模型组比较，针药组小鼠的逃避潜伏期明显缩短（P＜0.05）。见图1。

图1 各组小鼠逃避潜伏期Fig.1 Escape latency time of mice in various groups

2.2各组小鼠海马组织超微结构电镜下可见对照组小鼠海马神经元结构清晰，线粒体结构完整，核膜光滑，可见自噬泡；与对照组比较，模型组小鼠海马组织中线粒体肿胀，核膜粗糙不完整，线粒体嵴断裂变形，自噬泡减少；与模型组比较，中药组、针药组和针刺组小鼠海马组织中可见神经元部分不规则变形、萎缩，胞质内可见较多自噬泡，病理改变均有改善， 尤以针药组减轻最为明显。见图2。

2.3 Western blotting法检测各组小鼠海马组织中PI3K、AKT和mTOR蛋白表达水平与对照组比较， 其余各组小鼠海马组织中PI3K、 AKT 和mTOR 蛋白表达水平明显升高（P＜0.05）；与模型组比较，各剂量中药组、针刺组和针药组小鼠海马组织中PI3K、AKT 和mTOR 蛋白表达水平明显降低（P＜0.05）。见图3 和图4。

2.4免疫组织化学法检测各组小鼠海马组织中PI3K、AKT和mTOR蛋白表达水平与对照组比较， 其余各组小鼠海马组织中PI3K、 AKT 和mTOR 蛋白表达水平明显升高（P＜0.05）；与模型组比较，各剂量中药组、针刺组和针药组小鼠海马组织中PI3K、AKT 和mTOR 蛋白表达水平明显降低（P＜0.05）。各蛋白表达水平见图5，各蛋白表达情况见图6～图8 （插页一和插页二）。

3 讨 论

ApoE 缺陷型小鼠显示出促动脉粥样硬化的脂蛋白谱，最终导致动脉粥样硬化。当饲喂高脂饮食时，ApoE 缺陷型小鼠表现出血脑屏障功能障碍和神经退行性变的迹象［11-12］，出现认知功能障碍，已被验证为实验性AD 模型［13］。 本课题组前期研究［14］ 显示：ApoE 基因敲除小鼠认知能力的降低与海马内自噬受损有关。针药并用对ApoE 基因敲除小鼠进行干预可通过上调小鼠海马组织中自噬水平从而改善其认知功能。

图2 透射电镜下观察各组小鼠海马组织超微结构（×20 000）Fig.2 Ultrastructures of hippocampus tissue of mice in various groups observed under transmission electron microscope(×20 000)

图3 各组小鼠海马组织中PI3K、AKT 和mTOR 蛋白表达电泳图Fig.3 Electrophoregram of expressions of PI3K, AKT,and mTOR proteins in hippocampus tissue of mice in various groups

图4 各组小鼠海马组织中PI3K、AKT 和mTOR 蛋白表达水平Fig.4 Expression levels of PI3K, AKT，and mTOR proteins in hippocampus tissue of mice in various groups

图5 各组小鼠海马组织中PI3K、AKT 和mTOR 蛋白表达水平Fig.5 Expression levels of PI3K, AKT, and mTOR proteins in hippocampus tissue of mice in various groups

基于痰瘀互结为认知功能障碍的发病关键。本研究采用针药并用以 “化痰祛瘀，醒脑开窍”。二陈汤燥湿化痰、理气和中，桃红四物汤养血活血、祛瘀生新。基于痰瘀同属于阴，同气相求，相互为病，使疾病迁延难愈。因此治疗时多联合应用二陈汤和桃红四物汤［14-15］。百会、关元二穴，一阴一阳，配伍为用，通达督任，使血脉充盈，肾精充沛，脑髓得养，共奏益髓健脑之功。丰隆为 “祛痰要穴”，有 “间接入脑” 一说，针刺丰隆可抑制炎症因子的释放，改善脂代谢，同时，也常用来治疗认知功能障碍疾病［16-17］。针药并举，内外兼治，起到事半功倍的效果。中医认为痰为浊邪，而心神性清净，故痰浊致病，易蒙蔽清窍，阻遏清阳，而致健忘，痴呆。清代陈士铎云认识到：“痰积于胸中，盘踞于心外， 使神明不清而成呆病矣”、 并提出“治呆无奇法，治痰即治呆。” 而大临床上多应用具有化痰开窍作用的方剂如温胆汤、 涤痰汤治疗AD，且疗效突出［18］。同时，《伤寒论》 曰：“阳明病，使人善忘者，必有蓄血，所以然者，本有久瘀血”。治疗以抵当汤，祛逐瘀血，使气血得以荣养脑髓，使脑络复畅。《医林改错》 中也提到：“凡有瘀血皆令人善忘”。均证明血瘀也是本病形成的重要原因之一。痰浊与瘀血，由津液和血液运化失常所产生的病理产物，“津血同源”，故 “痰瘀同源”。痰瘀互为因果，相互影响，常相兼为病，进一步加重气血运行障碍，使疾病迁延难愈。“痰” 和 “瘀” 为AD 病机的关键因素［19］。越来越多的证据表明，自噬功能障碍与异常的蛋白聚集所致的神经退行性疾病（如AD） 密切相关［20］。当自噬的调节能力下降时，影响细胞识别及降解受损线粒体的能力，从而使破损或衰老的细胞器、长寿命蛋白质、错误合成或折叠错误的蛋白质等物质的过度堆积，最终产生病理性产物 “垃圾”。这一病理过程与中医的内生痰浊瘀血过程相同。

实验小鼠因ApoE 基因被敲除而更容易出现脂质代谢紊乱，血脂异常堆积使得发生血管内皮炎性损伤进而受到氧化应激的损害，最终出现认知功能障碍。本研究采用Morris 水迷宫检测小鼠水中学习寻找隐藏平台的能力，以此来判定小鼠的空间学习和记忆能力。实验结果显示：对照组小鼠游泳动作娴熟，速度快，往往很快就能找到平台，即对照组小鼠的学习及记忆能力强； ApoE 基因敲除的模型组小鼠游泳动作笨拙，速度慢，需要花长时间才能找到平台，说明ApoE 基因与记忆认知能力有相关性。张 宁 等［21］发 现：ApoE 基 因 敲 除 小 鼠 海 马 神经组织中Aβ 表达水平明显高于正常小鼠，ApoE 基因的异常表达与AD 的发病有密切关系。经过针药并用干预后，小鼠逃避潜伏期缩短，证明基于化痰祛瘀法的针药并用干预方案能够改善APOE 基因敲除小鼠的认知功能。

研 究［22］证 明：损 害 神 经 元 的Aβ 异 常 沉 积 是诱导AD 发生发展的核心因素，而AD 患者脑组织中均有不同程度自噬功能的损伤，无法及时减少Aβ 的生成和清除Aβ，最终引发AD。电镜下观察小鼠海马的超微结构结果显示：对照组小鼠海马内细胞器丰富且有大量的自噬泡和溶酶体；ApoE 基因敲除小鼠海马内的自噬泡和溶酶体的数量减少，提示ApoE 基因敲除可能损害了小鼠海马组织中神经元，并且自噬过程发生了异常变化；而经过针药干预后，海马组织中的自噬泡及溶酶体数量增多，提示针药干预可以增强自噬途径以此来改善ApoE基因敲除小鼠的学习和记忆能力。为探讨可能的作用机制，本研究采用Western blotting 和免疫组织化学法检测各组小鼠海马组织中PI3K、 AKT 和mTOR 蛋白的表达情况。

PI3K/AKT/mTOR 信号通路作为与细胞自噬密切相关的转导通路，参与和调节许多细胞活性，如细胞存活、增殖和生长等［23］。PI3K 分为Ⅰ型、Ⅱ型和Ⅲ型，而PI3K/AKT/mTOR 通路是指Ⅰ型PI3K，PI3K 作为自噬的负调节因子，其磷酸化水平在调节细胞增殖和死亡中发挥着关键作用。AKT 参与各种信号通路的调节， 包括细胞增殖、生长、存活、血管生成和化疗耐药等［24］，AKT是PI3K 的下游效应子和mTOR 的上游调节分子。mTOR 作为AKT 的直接靶点，被AKT 磷酸化激活后，不同的下游通路得到调控，特定的蛋白质合成得到控制，进而参与了细胞的自噬和凋亡。此外，mTOR 可抑制自噬体复合物形成所需的相关蛋白，从而抑制自噬，被认为是自噬的负调节物。多数药物通过下调PI3K/Akt/mTOR 途径或抑制mTOR 从而诱导自噬［25-26］。本研究结果显示：模型组小鼠海马组织中PI3K、AKT 和mTOR 蛋白表达水平明显高于对照组，说明ApoE 基因敲除小鼠PI3K/AKT/mTOR 的信号通路被激活，该结果与张利达等［27］的实验结果一致。采用针药并用干预后，针药组小鼠海马组织中PI3K、AKT 和mTOR的蛋白表达明显低于模型组，由此推测化痰祛瘀法针药并用可能通过抑制PI3K/AKT/mTOR 的信号通路来增强细胞自噬现象，以此改善认知障碍。

综上所述， 化痰祛瘀法针药并用可以上调PI3K、AKT 和mTOR 蛋白表达水平，抑制PI3K/AKT/mTOR 信号通路的异常激活，缓解或增强细胞的自噬途径作用， 以此达到恢复认知能力的作用。