氨基化二氧化硅颗粒应用于大豆油DNA提取研究

姚 芹，张 帅，王广通，张 强

(苏州农业职业技术学院 食品科技学院，江苏省食品安全快速检测工程技术研究开发中心，江苏省高等职业教育产教深度融合实训平台，江苏 苏州 215008)

近年来，转基因产品的安全性问题日益受到全世界的关注。我国进口大豆绝大部分都是转基因大豆，且主要用于榨油，因此大豆油的转基因成分检测十分重要[1]。Nikolic等[2]用CTAB法和试剂盒法提取大豆毛油DNA，用于后续PCR扩增检测，但CTAB法提取的DNA纯度不高，试剂盒法费用较高。而NY/T 674—2003《转基因植物及其产品成分检测 DNA提取和纯化》中用有机溶剂反复抽提，去除蛋白质、多糖和酚类，但有机溶剂用量较大。二氧化硅微粒是一种微吸附剂，具有吸附富集核酸的特性，近年来改性二氧化硅或磁性二氧化硅在高分子生物学研究领域中用于提取DNA和RNA，且效果较好[3-6]。刘玲玲[7]、林霞[8]利用具有两性离子的赖氨酸对二氧化硅表面进行修饰，通过直接静电作用提高DNA在介质表面的吸附效率，或制备出可有效结合DNA的基因载体。郑昆等[9]采用共沉淀法合成氨基化介孔二氧化硅纳米材料，该材料能有效地吸附和保护质粒DNA。因此，本文利用氨基化二氧化硅颗粒富集大豆及大豆油中DNA，测定大豆毛油及精炼油中转基因成分，同时考察大豆油生产过程中DNA浓度和片段长度变化情况。本方法基本不涉及有机溶剂，且可有效富集DNA，为油脂中转基因成分的检测提供新的方法。

1 材料与方法

1.1 实验材料

1.1.1 原料与试剂

含CaMV35s启动子、CP4EPSPS基因的转基因Roundup Ready大豆，阿根廷；转基因压榨大豆毛油、转基因一级精炼大豆油，江苏省南通荣丰油厂提供。氨基化二氧化硅，购于杭州新越生物技术有限公司，粒径500 nm，使用时以无水乙醇分散，固体含量2.5%；PCR Mix(Taq DNA聚合酶、dNTPs、Mg2+、反应缓冲液)、DNA Ladder，上海生工生物工程有限公司；引物(见表1)，金唯智生物科技有限公司。

表1 引物名称、序列、扩增片段大小及退火温度

1.1.2 仪器与设备

PCR仪，Mastercycler ep Eppendorf 中国有限公司；Biorad GelDoc XR 伯乐凝胶成像系统，美国。

1.2 实验方法

1.2.1 试剂配制

裂解液：TNE缓冲液中加入SDS至终质量浓度为5～20 μg/mL，pH为8.0。

结合液：将6.06 g Tris和5.84 g EDTA溶于水中，使用1 mol/L HCl和1 mol/L NaOH调节pH为6.5，加入591 g的异硫氰酸胍(GuSCN)溶于溶液中，再加入10 mL Triton-X100，用水定容至1 000 mL。溶液组分的终浓度为Tris-HCl 50 mmol/L、EDTA 20 mmol/L、GuSCN 5 mol/L、Triton-X100 1%溶液，pH为6.5。

洗液1：称取1.46 g NaCl和6.06 g Tris溶于水中，并用1 mol/L HCl和1 mol/L NaOH调节pH为6.4，再加入591 g的GuSCN溶于溶液中，用水定容至1 000 mL。溶液组分的终浓度为GuSCN 5 mol/L、NaCl 25 mmol/L、Tris-HCl 50 mmol/L、pH为6.4。

洗液2：称取7.3 g NaCl和1.21 g Tris溶于水中，用1 mol/L HCl和1 mol/L NaOH调节pH为8.0，加水定容至1 000 mL，将无水乙醇用此溶液配制成体积分数为80%的乙醇溶液。

1.2.2 国标法提取大豆毛油DNA

参照NY/T 674—2003 《转基因植物及其产品成分检测 DNA提取和纯化》进行。具体为取大豆毛油30 mL放入100 mL离心管中，加入25 mL正己烷，振荡混合2 h后，加入25 mL CTAB提取缓冲液，继续振荡混合2 h。10 000g离心10 min，取水相，加入等体积异丙醇，轻缓颠倒混匀，-20℃下静置1 h，10 000g离心10 min。取沉淀用400 μL TE缓冲液溶解后，加入200 μL氯仿-异戊醇(体积比24∶1)，轻缓颠倒混匀，10 000g离心2 min。将上清液转移至干净离心管中，加入等体积异丙醇，轻缓颠倒混匀，-20℃下静置1 h，10 000g离心10 min。取沉淀用1 mL 70%乙醇溶液洗涤，倒出上清。沉淀干燥，得大豆毛油DNA，将其溶解于100 μL TE缓冲液中，待测。

1.2.3 氨基化二氧化硅法提取大豆及大豆油中的DNA

大豆的预处理：大豆洗净，液氮研磨成糊状。

大豆毛油及精炼油的预处理：取200 mL大豆油，与20 mL TE缓冲液混合，常温下置于磁力搅拌器上搅拌混匀30 min，将混合液移至分液漏斗中静置，待分层后取下层水相。

取3支2 mL EP管分别加入预处理后的大豆20 mg、大豆毛油300 μL、精炼油300 μL，各加300 μL裂解液和20 μL蛋白酶K，涡旋振荡摇匀后，65℃水浴60 min。裂解后以12 000g离心5 min，上清液转移到新的EP管中，加入500 μL结合液，再加入氨基化二氧化硅乙醇分散液30 μL，振荡后放置室温20 min。将离心管5 000g离心2 min，弃上清。加洗液1，并使氨基化二氧化硅颗粒充分悬浮，10 000g以上离心20 s，弃上清。加洗液2并使氨基化二氧化硅颗粒充分悬浮，10 000g以上离心20 s，弃上清，重复洗涤1次。10 000g以上离心20 s，移去残留液体，室温晾干。加入30 μL TE缓冲液，振荡混匀后65℃温育5 min，12 000g离心2 min，上清移至新的EP管中备用。

1.2.4 DNA的定量分析

取20 μL DNA提取液稀释100倍，紫外分光光度计测定其260、280 nm吸光值，计算OD260/OD280比值，以1个OD260相当于50 μg/mL DNA计算DNA质量浓度。DNA质量浓度=50×OD260×稀释倍数。

1.2.5 DNA体外扩增反应体系构建及反应条件

采用25 μL反应体系，在PCR管中依次加入双蒸水 10.5 μL， PCR Mix 12.5 μL，上游引物0.5 μL，下游引物0.5 μL，DNA模板1 μL。热循环条件为94℃预变性5 min; 94℃变性30 s，各条带不同的退火温度低温退火30 s，72℃延伸45 s，Lectin-1、CP4EPSPS-1片段扩增为40个循环，其余扩增均为38个循环；72℃后延伸7 min。

2 结果与讨论

2.1 氨基化二氧化硅法提取大豆DNA定量结果

按1.2.4方法测得大豆提取液的OD260/OD280比值为1.64，略低于1.7，说明本方法提取大豆DNA有少量蛋白质污染，按公式计算得到氨基化二氧化硅法提取的大豆DNA样品的DNA质量浓度为86.5 μg/mL。

2.2 大豆毛油DNA提取定量结果

分别按1.2.2和1.2.3提取大豆毛油中DNA，按1.2.4方法测定OD260/OD280比值和DNA质量浓度，得出国标法提取大豆毛油OD260/OD280比值为1.82，DNA质量浓度为6.45 μg/mL；氨基化二氧化硅法提取大豆毛油OD260/OD280比值为1.75，DNA质量浓度为10.65 μg/mL。氨基化二氧化硅法提取大豆毛油DNA的OD260/OD280比值略低于国标法，但DNA质量浓度比国标法的高。此外，氨基化二氧化硅法提取的大豆毛油DNA质量浓度远低于该法提取的大豆DNA的质量浓度，这是因为压榨并不能使大豆中DNA全部进入油中，大部分DNA残留在大豆饼粕中。

2.3 大豆毛油PCR扩增结果(见图1)

注：M.Marker；1.转基因大豆引物Lectin-1；2.转基因大豆引物CP4EPSPS-1；3.转基因大豆引物Lectin-2；4.转基因大豆引物CP4EPSPS-2；5.转基因大豆引物Lectin-3；6.转基因大豆引物CP4EPSPS-3；7.大豆毛油引物Lectin-1；8.大豆毛油引物CP4EPSPS-1；9.大豆毛油引物Lectin-2；10.大豆毛油引物CP4EPSPS-2；11.大豆毛油引物Lectin-3；12.大豆毛油引物CP4EPSPS-3。

由图1可以看出，氨基化二氧化硅法提取大豆毛油DNA用于大豆内、外源基因扩增，大豆毛油中1 500 bp左右的条带和400 bp左右的条带均未扩增出来，这可能是因为压榨过程中料坯受到强大的压力，压榨温度一般达到100～135℃，并且持续压榨时，加热与压力的联合作用，使蛋白质变性，大豆DNA和蛋白质紧密结合形成染色质，蛋白质空间结构解体会导致DNA片段的降解。但大豆毛油中扩增到了118 bp的内源基因片段和190 bp的外源基因片段，且条带清晰。

2.4 大豆毛油转基因调控元件扩增结果(见图2)

注：M.Marker； 1.转基因大豆引物CaMV35S；2.转基因大豆引物NOS；3.大豆毛油引物CaMV35S；4.大豆毛油引物NOS。

由图2可以看出，氨基化二氧化硅法提取大豆毛油DNA扩增出了大豆外源基因调控元件，且条带清晰。

2.5 精炼大豆油PCR扩增结果(见图3)

由图3可以看出，氨基化二氧化硅法提取的精炼大豆油DNA，定性PCR未扩增出大豆内、外源基因条带。这是由于精炼大豆油中DNA量甚微，需要高效的DNA富集技术结合灵敏度高的检测方法如实时荧光定量PCR、巢式PCR才能检测[10-13]。说明氨基化二氧化硅法不适用于精炼大豆油DNA的提取。

注：M.Marker； 1.转基因大豆引物Lectin-1；2.转基因大豆引物CP4EPSPS-1；3.转基因大豆引物Lectin-2；4.转基因大豆引物CP4EPSPS-2；5.转基因大豆引物Lectin-3；6.转基因大豆引物CP4EPSPS-3；7.精炼大豆油引物Lectin-1；8.精炼大豆油引物CP4EPSPS-1；9.精炼大豆油引物Lectin-2；10.精炼大豆油引物CP4EPSPS-2；11.精炼大豆油引物Lectin-3；12.精炼大豆油引物CP4EPSPS-3。

3 结 论

(1)本研究以正电荷的氨基化二氧化硅颗粒为载体，富集大豆毛油中的DNA。和国标法相比，氨基化二氧化硅法提取大豆毛油中的DNA质量浓度较高。

(2)氨基化二氧化硅法提取的大豆毛油DNA定性PCR扩增出了内、外源基因及外源基因调控元件的清晰条带，而精炼油DNA未扩增到内、外源基因条带。该方法只适用于大豆毛油的DNA提取，不适用于精炼油的DNA提取。