不同来源大豆毛油磷脂组成的核磁检测及磷脂酸含量比较

俞 乐，丛 芳，王兴国，金青哲，姜元荣

(1.江南大学 食品学院，江苏 无锡214122； 2.丰益(上海)生物技术有限公司，上海 200137)

检测分析

不同来源大豆毛油磷脂组成的核磁检测及磷脂酸含量比较

俞 乐1，丛 芳2，王兴国1，金青哲1，姜元荣2

(1.江南大学 食品学院，江苏 无锡214122； 2.丰益(上海)生物技术有限公司，上海 200137)

植物毛油中存在一定量以磷脂为主的胶质。为保证后续物理精炼顺利进行，植物毛油需先经过脱胶处理。综合考虑原料产地、加工工艺、生产批次等因素，收集了25种不同大豆毛油，利用31P NMR 技术对其进行磷脂组成分析，并研究了毛油中的磷脂酸含量与其他杂质间的关系。结果表明：不同品种大豆制备的毛油在磷脂组成上存在显著性差异(p<0.05)，而磷含量没有显著性差异；随着储藏温度升高，毛油磷脂中磷脂酸占比有一定程度上升；大豆毛油中磷脂酸的含量与金属离子含量极显著正相关(p<0.01)，与游离脂肪酸含量(以酸值表示)不存在显著性关联(p>0.05)。

大豆毛油；磷脂组成；核磁检测；磷脂酸

毛油脱胶处理中，水化磷脂通常易于分离，非水化磷脂则难以通过常规水化脱胶、酶法脱胶[1]去除。毛油中的非水化磷脂主要由磷脂酸(PA)的钙镁盐组成[2]，毛油磷脂的PA比例过高，则不利于脱胶进行，影响成品油品质。油料运输、储存、生产过程中，由于其中磷脂酶(如磷脂酶A、磷脂酶D等)[3]的作用，毛油磷脂中磷脂酰胆碱(PC)等水化磷脂含量下降。在磷脂酶A的作用下，水化磷脂被水解为溶血磷脂及游离脂肪酸[4]。磷脂酶D作用于磷脂质的磷酸二酯键，能够将PC等磷脂水解为PA和羟基化合物[5]。

磷脂检测的常用方法主要有薄层色谱法(TLC)和高效液相色谱法(HPLC)。TLC很难将所有组分完全分开；HPLC对样品需要进行复杂的前处理，存在检测器选择等问题[6-7]。近年来随着核磁检测技术的进步，利用31P核磁共振(31P NMR)检测磷脂逐渐受到人们关注，该方法对含磷组分的选择具有唯一性，不受其他元素的干扰，具有预处理简便、分析快捷、分辨率高等优点[8]。

目前，国内鲜有将31P NMR运用于植物毛油磷脂组成检测的报道。施邑屏等[9]曾利用该法检测大豆磷脂并进行了重复性定量验证，证实了31P NMR检测混合磷脂中单体组分的可行性。但实验中未很好地控制pH，检测过程中发生磷脂单体水解等不良副反应[10]，影响磷脂组分定量的准确性。而且施邑屏等[9]所使用的核磁工作频率仅为90 MHz，单峰信号的分离度不足。庞思勉等[11]运用该法检测了坚果中磷脂的组成，并对该法的定量性及检出限进行验证，结果同样存在检测工作频率低造成分离度不足的问题。近年来，国外一些学者研究了将31P NMR运用于植物毛油磷脂组成检测的方法[12]，但这些方法都需要先对毛油中的磷脂进行富集，再进行检测。

本文采用31P NMR检测25种不同来源大豆毛油中磷脂的PA含量，并探讨了PA含量与毛油中游离脂肪酸、金属离子含量的相关性，以期为脱胶方法的选择提供简单有效的判断依据。

1 材料与方法

1.1 实验材料

25种大豆毛油由益海嘉里集团提供；氘代氯仿、99.5%一水合氢氧化铯由Aldrich Chemical公司提供；其余试剂为分析纯，由国药集团化学试剂有限公司提供。钙镁检测时样品以10倍航空煤油稀释，实验用航空煤油由兰州炼油厂提供。

Bruker Ascend 400型超导核磁共振波谱仪，安捷伦7700x型ICP-MS。

1.2 实验方法

1.2.131P NMR检测磷脂组成[12]

称取80～90 mg油样，添加以氯仿稀释的磷酸三甲酯(TPP)溶液(体积比1∶50)为内标，添加量为5 μL。依次加入氘代氯仿，甲醇，pH为8.5、浓度为0.2 mol/L EDTA-Cs各600 μL，混匀后加入核磁共振管。

分析条件：31P NMR工作频率600 MHz；检测探头PABBO NMR；温度25℃；脉冲宽度11.2 μs；脉冲延迟时间2 s；扫描次数16；31P NMR的谱宽64 102 Hz；采样点数65 536。

采用内标法定量计算毛油中磷脂各组分的含量以及各磷脂组分在毛油的总磷脂中的占比。

1.2.2 指标测定

钙镁离子含量的测定参照AOCS检测方法Ca 20-99；酸值的测定参照GB/T 5530—2005；磷含量的测定参照GB/T 5537—2008。

1.2.3 数据处理

采用SPSS19.0进行显著相关性、显著差异性分析，相关性分析采用Person分析(p<0.05)，差异性分析采用ANOVA分析(p<0.05)。

2 结果与分析

2.1 大豆毛油磷脂的31P NMR分析

大豆毛油中的磷脂组分主要为磷脂酰胆碱(PC)、磷脂酰肌醇(PI)、磷脂酰乙醇胺(PE)、磷脂酸(PA)，此外还存在少量溶血磷脂酰胆碱(LPC)、溶血磷脂酰乙醇胺(LPE)、N-酰基磷脂酰乙醇胺(APE)等组分。影响磷脂31P NMR化学位移的主要因素为相连X基团的电负性、共轭性以及键角[13]，以磷原子为中心，相连各基团对称性越强，化学位移越向高场(正为低场，负为高场)移动，通过检测条件的优化，实现大豆磷脂各组分的有效检测。

图1为2015年6月份由益海嘉里南天工厂提供的以巴西大豆为原料的大豆毛油的31P NMR检测图谱。由图1可以看出，除了4种主要磷脂外，含量较低的溶血磷脂、APE等也均在图上得到了分开的单峰信号。各主要峰分离度高，峰型规整，检测效果良好。

图1 大豆毛油的 31P NMR检测图谱

2.2 大豆毛油的PA占比、磷含量、金属离子含量、酸值

本实验涉及25种毛油使用了来自4个不同国家的大豆，由益海嘉里集团下属的8个不同地区工厂生产提供。其中14种大豆毛油以巴西大豆为原料，4种大豆毛油以美国大豆为原料，4种大豆毛油以国产大豆为原料，2种大豆毛油以阿根廷大豆为原料，1种大豆毛油的原料为美国大豆和巴西大豆的混合大豆。25种大豆毛油的PA占比(以在磷脂中计)、磷含量、钙镁离子含量和酸值见表1。

表1 25种大豆毛油的PA占比(以在磷脂中计)、磷含量、钙镁离子含量和酸值

由表1可以看出，25个油样中有7个样品的PA占比超过30%，这些样品均以来自巴西的大豆为原料。巴西大豆制得毛油的磷脂中，PA占比极显著高于其他地区大豆生产的毛油(p<0.01)。美国大豆为原料制取的毛油中，PA在磷脂中的占比显著低于其他大豆毛油(p<0.05)，两种PA占比最低的样品，均使用了来自美国的大豆为原料。中国及阿根廷的大豆制得的毛油PA在磷脂中的占比处于中等水平，大部分在20%～25%之间。不同地区大豆生产的毛油在磷含量上不存在显著性差异。

对采集的25种毛油进行钙、镁、铁、铜、镍等全金属离子分析后发现，所有毛油中钙、镁离子的含量均远远高于其他金属离子，因此可以用钙镁离子含量代表毛油中的金属离子含量。25个样品中，钙镁离子含量超过300 mg/kg的3种大豆毛油，均由巴西大豆制得，同时也有一些巴西大豆毛油的钙镁离子含量较低，其中3种大豆毛油的钙镁离子含量低于200 mg/kg，总体而言，巴西大豆毛油与其他来源大豆生产的毛油，在钙镁离子含量上不存在显著性差异。与其他毛油相比，美国大豆毛油的钙镁离子含量显著偏低(p<0.05)，其中最高的美国大豆毛油钙镁离子含量仅为226.70 mg/kg。

不同来源大豆毛油在酸值上同样存在显著性差异。巴西大豆毛油的酸值显著高于其他大豆毛油(p<0.05)，美国大豆毛油的酸值显著低于其他来源大豆毛油(p<0.05)。就所采集样品而言，巴西大豆毛油的平均酸值(KOH)为2.57 mg/g，美国大豆毛油平均为1.08 mg/g，阿根廷大豆毛油平均为2.36 mg/g，中国大豆毛油平均为1.43 mg/g；美国、巴西混合大豆所制毛油的酸值(KOH)为 3.11 mg/g，高于美国大豆毛油和巴西大豆毛油的平均值。

值得注意的是，10号、11号、14号样品均由同一家工厂提供，且原料为同批进口大豆，生产时间分别为2015年7月、8月、6月。3批毛油中，7月份生产的大豆毛油PA占比略高于另外两个月生产的大豆毛油。根据当地气象资料，该地区2015年7月份平均气温为全年最高，为32℃左右，其他月份的平均气温均未超过30℃，7月份大豆内磷脂酶酶活力最高[14]，这可能是该样品的磷脂组成中PA占比略高的原因。

2.3 大豆毛油的PA含量与金属离子含量及酸值间的相关性分析

考察25种大豆毛油中PA含量与钙镁离子含量的关系，结果如图2 所示。

图2 大豆毛油中PA含量与钙镁离子含量的关系

经分析，大豆毛油中PA含量与金属离子含量存在极显著正相关关系，相关系数为0.738(p<0.01)。PA的结构中有两个羟基，与二价金属离子，如钙、镁离子等，有很强的亲和力[2]，当其他条件相仿时，大豆毛油中的PA含量增高通常会导致金属离子含量的上升。

阿根廷大豆制取的毛油与其他样品相比，每毫克PA结合到的钙镁离子量极显著偏高(p<0.01)，每毫克PA平均结合到0.082 mg钙镁离子。巴西大豆和国产大豆生产的毛油每毫克PA平均结合到0.050 mg左右钙镁离子，美国大豆毛油每毫克PA平均结合到0.060 mg 钙镁离子。可见大豆的品种、生长环境等条件可能会影响PA含量与金属离子含量间的关系[15]。

毛油生产工艺也可能对PA含量与金属离子含量间的关系造成影响。本实验收集的毛油绝大多数为浸出法制备的毛油，但21号大豆毛油通过压榨法生产得到，该毛油中每毫克PA结合到的钙镁离子与其他浸出法国产大豆毛油相比，显著偏高，正常国产浸出大豆毛油每毫克PA平均结合钙镁离子为0.037 mg 左右，压榨大豆毛油每毫克PA平均结合钙镁离子为0.066 mg。此外，大豆品质也可能影响PA与金属离子结合能力，劣质国产浸出大豆毛油(19号样品)每毫克PA平均结合量达0.058 mg(以钙镁离子计)。

考察25种大豆毛油中PA含量与酸值的关系，结果如图3所示。

图3 大豆毛油中PA含量与酸值的关系

经分析发现，大豆毛油所含PA的含量与游离脂肪酸含量(以酸值表示)不存在显著性关联(p>0.05)。

3 结 论

以收集到的25种以不同来源大豆为原料，对由不同工厂在不同时间段加工生产制得的毛油进行分析后发现，大豆的来源、储存温度、生产工艺等条件均可能对毛油中包括磷脂、金属离子、游离脂肪酸在内的杂质组成和含量造成一定影响。本实验涉及的样品中，以巴西大豆为原料制取的大豆毛油PA占比和游离脂肪酸含量普遍较高；美国大豆制得的大豆毛油PA占比低、游离脂肪酸含量少，品质普遍较好。生产工艺对大豆毛油品质存在一定影响，当原料、生产工艺等条件相近时，环境温度对生产的大豆毛油品质也有一定影响。

在工厂的实际生产中，磷脂组分的定量检测存在诸多不便。本文考察了金属离子及酸值与磷脂酸含量间的关系，发现大豆毛油中金属离子含量与PA含量存在极显著正相关关系，酸值与PA含量不存在显著性关联。对于工厂而言，可以通过金属离子含量大致推测毛油中非水化磷脂的含量高低，指导后续脱胶方法、条件的选择。

[1] DIJKSTRA A J. Enzymatic degumming[J]. Eur J Lipid Sci Technol，2010，112(11)：1178-1189.

[2] DIJKSTRA A J. Degumming[M]. New York：Springer，2013：121-155.

[3] WANG X M. Regulatory functions of phospholipase D and phosphatidic acid in plant growth，development，and stress responses [J]. Plant Physiol，2005，139(2)：566-573.

[4] 张康逸，张丽霞，王兴国，等. 磷脂酶A1(LecitaseUltra) 的氨基酸序列分析及催化机理[J]. 中国粮油学报，2016，31(2)：70-74.

[5] 杨学利，马沁沁，袁向华，等. 磷脂酶 D 及其催化机制的研究进展[J]. 中国油脂，2016，41(3)：80-84.

[6] 胡小中，温光源，龙金林. 磷脂分析检测技术研究进展[J]. 中国油脂，2003，28(3)：41-44.

[7] 张颖颖，杨亦文，吴彩娟，等. 磷脂分析检测方法的研究进展[J]. 中国医药工业杂志，2006，37(1)：58-62.

[8] GLONEK T.31P nuclear magnetic resonance phospholipid analysis of anionic-enriched lecithins[J]. J Am Oil Chem Soc，1998，75(5)：569-573.

[9] 施邑屏，黎燕斌，孙玲玲，等.31P核磁共振光谱及薄层色谱分析针剂大豆卵磷脂[J]. 分析化学，1991，19(7)：733-736.

[10] MENESES P，GLONEK T. High resolution31P NMR of extracted phospholipids[J]. J Lipid Res，1988，29(5)：679-689.

[11] 庞思勉，张明霞，姬红萍.31P核磁共振光谱法测定坚果类食品中的6种磷脂[J]. 理化检验(化学分册)，2016，52(1)：44-47.

[12] YAO L X，JUNG S.31P NMR phospholipid profiling of soybean emulsion recovered from aqueous extraction[J]. J Agric Food Chem，2010，58(8)：4866-4872.

[13] KUHL O. Phosphorous-31 NMR spectroseopy[M]. Berlin Heidelberg：Springer-Verlag，2008：9-22.

[14] 黄年英. 大豆的前处理对油品质量的影响——介绍西德鲁奇公司ALCON工艺[J]. 油脂科技，1985，10(2)：12-20.

[15] 李丽，游向荣，孙健，等. 植物磷脂酶D基因表达与衰老的关系[J]. 热带亚热带植物学报，2012，20(1)： 99-106.

Determination of phospholipids composition in crude soybean oil from different sources by nuclear magnetic resonance and comparison of phosphatidic acid content

YU Le1，CONG Fang2，WANG Xingguo1，JIN Qingzhe1，JIANG Yuanrong2

(1. School of Food Science and Technology，Jiangnan University，Wuxi 214122，Jiangsu，China;2.Wilmar Biotechnology Research & Development Center (Shanghai) Co.，Ltd.，Shanghai 200137，China)

The crude vegetable oil contained a finite amount of colloid substance which was mainly composed of phospholipids. In order to ensure the smooth operation of physical refining，the crude vegetable oil needed to be degummed firstly. Comprehensive considering the factors of origin，processing technology and production batch，25 kinds of crude soybean oils were collected and their phospholipids compositions were analyzed by31P NMR.The relationships between the contents of phosphatidic acid content and other impurities in crude oil were studied. The results showed that there were significant differences in phospholipids compositions in crude oils which were made from different varieties of soybeans (p<0.05)，but there was no significant difference in phosphorus content. The proportion of phosphatidic acid in phospholipids increased with the storage temperature rising. The contents of phosphatidic acid and metal ions in crude soybean oil were markedly positive correlated(p<0.01). There was no significant correlation between the contents of phosphatidic acid and free fatty acids(p>0.05).

crude soybean oil; phospholipid composition; NMR; phosphatidic acid

2016-04-05；

2016-09-26

俞 乐(1990)，女，在读硕士，研究方向为植物油的磷脂检测及酶法脱胶(E-mail)lyhappyfish@126.com。

王兴国，教授(E-mail)wxg1002@qq.com。

TS225.1;TQ646

A

1003-7969(2017)01-0130-04