温敏性低共熔溶剂双水相萃取分离油用牡丹籽粕多糖

张喜峰，王鑫鑫，张青婷，罗光宏

(1.河西学院 生命科学与工程学院，甘肃 张掖 734000； 2.甘肃省河西走廊特色资源利用重点实验室，甘肃 张掖 734000；3.河西学院 甘肃省微藻工程技术研究中心，甘肃 张掖 734000)

油用牡丹籽粕为油用牡丹籽榨油后的副产品，通常被作为肥料或动物饲料。然而，油用牡丹籽粕含有蛋白质、芍药苷、丹皮酚、低聚茋类化合物等生物活性成分[1-2]，多糖作为其最重要成分之一，具有抗肿瘤、抗疲劳、抗病毒、抗氧化和免疫调节的药理活性[3-5]。因此，多糖的开发利用具有重要意义。传统的水提法、酶提取法和碱提取法广泛应用于植物多糖的提取[6-8]。水提法简单，成本低，但效率不高。酶提取法需要苛刻的操作条件，增加了生产成本。虽然碱提取法能提高多糖的溶出率，但部分多糖可能会发生分解。因此，开发一种绿色、高效的多糖提取方法具有重要意义。

低共熔溶剂(DES)是由氢键受体(HBAs)和氢键供体(HBDs)按照一定摩尔比形成的混合物，也被称为离子液体(ILs)类似物。除与ILs相似的性质外，DES还具有成本低、制备简单、生物毒性低、生物降解性好等优点[9-10]。因此，在萃取领域中，DES绿色溶剂替代了一些生物毒性高、生物降解性低的离子液体，广泛应用于植物资源中多种有效成分的提取，如橄榄油渣中的酚类化合物[11]、槐花中的黄酮[12]、长春花中的花青素[13]等。

双水相体系(ATPS)作为一种液-液萃取技术，已广泛应用于食品、医药、化工等领域。目前，已形成了不同类型的ATPS，如PEG/盐[14]、PEG/葡聚糖[15]、有机溶剂/盐[16]、ILs/盐水[17]、DES/盐水和温敏性聚合物/盐[18]。与其他ATPS相比，温敏性ATPS不仅保留了ATPS的特性，还可通过改变温度实现ATPS的成相组分和目标化合物分离。环氧乙烷-环氧丙烷共聚物(EOPO)是一种温敏性聚合物,在温度诱导下可实现相分离。目前，基于EOPO的ATPS已广泛应用于苦参碱[19]、食物中痕量环丙沙星[18]和天然产物中生物活性成分[20]的提取。

本文以制备的16种DES为提取剂，研究DES种类、含水量、固液比、提取温度、提取时间对油用牡丹籽粕多糖提取效果的影响，采用热分离ATPS对油用牡丹籽粕多糖进行初步纯化，研究EOPO相对分子质量、终质量分数和萃取温度对多糖萃取效果的影响，通过温度诱导相分离回收多糖和EOPO，并对多糖相对分子质量、组成等进行了分析测定，以期为多糖的深度开发提供参考依据。

1 材料与方法

1.1 试验材料

油用牡丹籽粕，由甘肃牡丹园林工程有限公司提供，经干燥、粉碎、过筛后备用。

苄基三正丙基氯化铵、氯化胆碱、甜菜碱、丙氨酸、尿素、乙二醇、乳酸、甘油、苹果酸、乙酰丙酸、苯乙酸等，上海源叶生物科技有限公司；EOPO(相对分子质量分别为2 000、2 500、2 870，分别记为EOPO2000、EOPO2500、EOPO2870)，浙江绿科安化学有限公司；光谱纯溴化钾、葡萄糖标准品、苯酚、浓硫酸等，成都德斯特生物科技有限公司。

PL-203电子天平，梅特勒-托利多仪器有限公司；Nicolet iS50傅里叶变换红外光谱仪，美国Thermo Scientific；V1100紫外可见分光光度计，上海美析仪器有限公司；GC-MS6800气相色谱质谱联用仪，江苏天瑞仪器股份有限公司；GPC-IR高效凝胶渗透色谱仪，北京亿路达机电设备有限公司。

1.2 试验方法

1.2.1 DES的制备

参照文献[21]方法，在80℃下，将一定摩尔比的氢键受体(HBAs)和氢键供体(HBDs)混合物加热搅拌一定时间后获得均匀透明的液体，即为DES。具体的HBAs与HBDs摩尔比及含水量为30%的DES黏度和pH如表1所示。

表1 DES的制备条件及产品指标

续表1

1.2.2 多糖的提取

取一定量油用牡丹籽粕粉，加入体积分数为90%的乙醇于索氏提取器，在70℃处理4 h，以除去大部分脂肪，脱脂后的残渣在40℃干燥后得到脱脂油用牡丹籽粕粉。脱脂油用牡丹籽粕粉与一定含水量的DES按一定固液比混合，超声处理一定时间后，4 000 r/min离心10 min，收集上清液，经Sevag法反复多次除蛋白，得多糖粗提液。按照式(1)计算多糖得率(y1)。

(1)

式中：C为粗提液多糖的质量浓度，mg/mL；V为粗提液的体积，mL；m为油用牡丹籽粕粉的质量，g。

1.2.3 多糖的EOPO/DES双水相萃取

取1 mL多糖粗提液，加入一定量EOPO，充分混匀后静置形成ATPs，其中上相为EOPO相，下相为DES相。按照式(2)计算多糖萃取率(y2)。

(2)

式中：C0和Cl分别为EOPO相和DES相多糖的质量浓度，mg/mL；V0和Vl分别为EOPO相和DES相的体积，mL。

1.2.4 多糖的回收

取1.2.3中EOPO相，置于70℃水浴以诱导形成两相，上相主要为EOPO(可重复使用)，下相为富含多糖的水相，水相减压浓缩、冷冻干燥后即得多糖(DES-P)。按照式(3)计算多糖回收率(y3)。

(3)

式中：Ct和Cb分别为上相和下相多糖的质量浓度，mg/mL；Vt和Vb分别为上相和下相的体积，mL。

1.2.5 多糖含量的测定

以葡萄糖为标准品采用苯酚硫酸法[4]测定多糖含量。

1.2.6 多糖理化特性测定

1.2.6.1 相对分子质量

参考Li等[22]的方法，在绘制相对分子质量校正标准曲线基础上，采用高效凝胶渗透色谱法(HPGPC)对多糖的平均相对分子质量进行测定。

1.2.6.2 单糖组成

参考秦春青等[23]的方法测定多糖的单糖组成。

1.2.6.3 结构表征

采用傅里叶变换红外光谱仪对多糖结构进行表征。多糖用KBr粉末研磨并压入一个直径为1 mm的小球中，在400～4 000 cm-1进行测定。

1.2.7 数据统计分析

试验数据采用Duncan多范围试验进行统计分析，p<0.05被认为具有统计学意义。所有数据中的误差棒表示3次重复试验的标准偏差。

2 结果与讨论

2.1 油用牡丹籽粕多糖的DES提取

2.1.1 DES种类对多糖提取效果的影响

固定固液比1∶30、DES含水量30%、提取温度50℃、提取时间40 min，研究16种DES对油用牡丹籽粕多糖提取效果的影响，结果如表2所示。

由表2可知，16种DES中，DES8具有最佳油用牡丹籽粕多糖提取效果(p<0.05)，这可能归因于DES8具有相对较低的黏度和弱酸性。据报道，DES物理特性如溶解度、黏度、表面张力和极性等因素是影响DES提取效果的重要因素[24]，高黏度会阻碍目标化合物在溶液中的扩散，传质效果弱[25]。此外，DES8中氢键供体乙二醇结构中含有两个羟基，多糖与乙二醇之间的氢键相互作用更强，可以提高多糖得率。因此，选择DES8作为提取剂进行后续研究。

表2 DES种类对油用牡丹籽粕多糖提取效果的影响 mg/g

2.1.2 DES含水量对多糖提取效果的影响

固定固液比1∶30、提取温度50℃、提取时间40 min，研究DES含水量对油用牡丹籽粕多糖提取效果的影响，结果如图1所示。

图1 DES含水量对油用牡丹籽粕多糖提取效果的影响

由图1可知，随着DES含水量由10%增加至50%，多糖得率呈逐渐增加趋势(p<0.05)，当DES含水量继续增加时，多糖得率逐渐下降。可能是因为适量水的加入可降低DES的黏度，提高传质效果，但含水量过大时会破坏HBAs、HBDs和多糖之间的氢键相互作用，导致DES的提取能力下降。因此，确定DES含水量为50%。

2.1.3 固液比对多糖提取效果的影响

固定DES含水量50%、提取温度50℃、提取时间40 min，研究固液比对油用牡丹籽粕多糖提取效果的影响，结果如图2所示。

图2 固液比对油用牡丹籽粕多糖提取效果的影响

由图2可知，在固液比1∶10～1∶30的范围内，多糖得率随固液比的增加而增加(p<0.05)，继续增加固液比时，多糖得率变化不显著(p>0.05)。可能是因为固液比较小时，会导致提取量不足，固液比过大会导致浪费，甚至不利于提取。因此，确定固液比为1∶30。

2.1.4 提取温度对多糖提取效果的影响

固定DES含水量50%、固液比1∶30、提取时间40 min，研究提取温度对油用牡丹籽粕多糖提取效果的影响，结果如图3所示。

图3 提取温度对油用牡丹籽粕多糖提取效果的影响

由图3可知，多糖得率随着提取温度的升高而增加，当提取温度超过50℃后，多糖得率呈下降趋势。可能是因为较高的温度可以加速分子的扩散，使细胞结构更易被破坏，促进多糖溶出，而过高的温度可能引起热敏性物质分解，影响其得率。因此，确定提取温度为50℃。

2.1.5 提取时间对多糖提取效果的影响

固定DES含水量50%、固液比1∶30、提取温度50℃，研究提取时间对油用牡丹籽粕多糖提取效果的影响，结果如图4所示。

图4 提取时间对油用牡丹籽粕多糖提取效果的影响

由图4可知，多糖得率在20～40 min范围内随提取时间延长逐渐增加(p<0.05)，而后随着提取时间的继续延长而降低。此现象归因于多糖在一定时间内溶出率提高，但过长的提取时间可能会破坏多糖的结构，降低其得率。因此，确定40 min为最佳的提取时间。

在以DES8为提取剂、DES含水量50%、固液比1∶30、提取温度50℃、提取时间40 min下按1.2.2进行多糖提取，测得多糖得率为96.58 mg/g。

2.2 EOPO/DES双水相萃取多糖

2.2.1 EOPO相对分子质量对多糖萃取效果的影响

取1 mL多糖粗提液，加入EOPO使其在溶液中终质量分数为55%，在萃取温度为45℃条件下，研究EOPO相对分子质量对多糖萃取效果的影响，结果见图5。

图5 EOPO相对分子质量对多糖萃取效果的影响

EOPO相对分子质量不同，其黏性也不同，从而影响双水相体系成相能力。由图5可知，在双水相体系中，相对分子质量为2 500的EOPO形成的双水相体系多糖萃取率最高，且与其他两种相对分子质量的EOPO相比，具有显著差异(p<0.05)，这归因于EOPO的链长、极性和黏度共同影响双水相萃取效果。因此，确定采用EOPO2500进行后续试验。

2.2.2 EOPO2500终质量分数对多糖萃取效果的影响

取1 mL多糖粗提液，加入不同量的EOPO2500使其形成不同终质量分数，在萃取温度为45℃条件下，研究EOPO2500终质量分数对多糖萃取效果的影响，结果见图6。

图6 EOPO2500终质量分数对多糖萃取效果的影响

由图6可知，多糖萃取率随着EOPO2500终质量分数逐渐增加而增加，当EOPO终质量分数为55%时，多糖萃取率达到最大。可能是因为较高质量分数的EOPO增加了多糖与EOPO间的接触面积，促进多糖优先分配在EOPO相。随着EOPO终质量分数的继续增加，多糖萃取率略有下降，可能是由于高质量分数下共聚物的熵效应和体积排阻效应的结果。另外，过高的质量分数导致其黏度较大，不利于多糖富集在EOPO相。因此，确定EOPO2500终质量分数为55%。

2.2.3 萃取温度对多糖萃取效果的影响

取1 mL多糖粗提液，加入EOPO2500使其终质量分数为55%，研究萃取温度对多糖萃取效果的影响，结果如图7所示。

图7 萃取温度对多糖萃取效果的影响

由图7可知，随萃取温度升高多糖萃取率增大，当萃取温度超过45℃时，多糖萃取率呈下降趋势。适当升高温度可以降低黏度，加速目标化合物在两相间的分布。但随着萃取温度不断升高，EOPO相饱和度增加，多糖的自由空间减小，降低了多糖萃取率。同时，EOPO是一种温度敏感性的聚合物，其浊点约在70℃[26]。当萃取温度持续接近浊点时，EOPO与多糖分离，阻碍多糖进入EOPO相。因此，确定萃取温度为45℃。

在EOPO/DES体系中，当EOPO2500终质量分数为55%、萃取温度为45℃时，多糖萃取率最高，为89.56%。

2.3 多糖的回收率

按1.2.4回收多糖，测得多糖回收率为86.15%。

2.4 多糖化学组成和结构特征

经测定，DES-P的纯度为76.59%，蛋白质含量为1.29%。结果表明，采用DES双水相提取油用牡丹籽粕多糖是一种有效的提取方法。

由HPGPC测定的DES-P的相对分子质量分布如图8所示。由图8可知，DES-P由两个对称的峰组成，表明二者属于不同种类。由校正曲线建立的回归方程为logMw=-0.341 1X+9.894 2(Mw为平均相对分子质量，X为洗脱时间)，相关系数(R2)为0.992 9。根据该方程计算DES-P的两个对称峰平均相对分子质量分别为67.76 kDa(88.26%)和2.26 kDa(11.74%)。

图8 DES-P相对分子质量分布

DES-P的总离子流图如图9所示，通过与单糖标准品的保留时间进行比较，确定DES-P主要由阿拉伯糖、甘露糖和葡萄糖组成，其摩尔比为1∶2.5∶0.78。

图9 DES-P的总离子流图

DES-P的红外光谱谱图如图10所示。由图10可知：在3 424、2 921 cm-1处的强吸收峰归因于O—H和C—H的拉伸振动；1 643、1 414 cm-1左右吸收峰归因于羧基和羰基的存在；1 000～1 200 cm-1吸收峰表明DES-P存在C—O—C和C—O—H；855 cm-1左右吸收峰归因于多糖中β-糖苷键。

图10 DES-P红外光谱图

3 结 论

在本研究中，构建了一种基于温度敏感性低共熔溶剂双水相萃取分离油用牡丹籽粕多糖的方法，采用DES(氯化胆碱-乙二醇)作为最佳提取剂，当其含水量50%，固液比1∶30、提取温度50℃、提取时间40 min时，多糖得率为96.58 mg/g。随后，采用EOPO/DES双水相萃取分离多糖，当EOPO2500终质量分数为55%、萃取温度为45℃时，多糖在EOPO相萃取率为89.56%；将EOPO相在70℃水浴进行温度诱导分相，实现了多糖的回收，回收率为86.15%；所制备的多糖(DES-P)的平均相对分子质量分别为67.76 kDa(88.26%)和2.26 kDa(11.74%)，由阿拉伯糖、甘露糖和葡萄糖组成，三者摩尔比为1∶2.5∶0.78。温敏性低共熔溶剂双水相体系ATPS具有环境友好、萃取能力强、操作简单、效率高、组分便于回收等特性，可作为多糖萃取分离的有效方法。