高效液相色谱法测定油茶饼粕多糖组成

2020-12-15李怡欣张盟雨张应中谢桂军李兴伟

中国油脂 2020年12期

李怡欣，张盟雨，王颂，王静，张应中，谢桂军，李兴伟

(广东省林业科学研究院广东省森林培育与保护利用重点实验室，广州 510520)

植物多糖是一种来源广泛的天然高分子化合物，一般由甘露糖、葡萄糖、半乳糖、木糖、阿拉伯糖、鼠李糖、岩藻糖等单糖及葡萄糖醛酸、半乳糖醛酸等组成[1]。多糖不仅可作为能量资源和结构材料，还参与生命现象中细胞的各种活动，具有抗氧化、降血糖、抗衰老、免疫调节等多种生物活性[2]。目前紫芝多糖、香菇多糖、黄芪多糖、猪苓多糖、人参多糖等植物多糖产品已被应用于治疗神经衰弱、抗肿瘤、增强免疫力等医药领域[3]。油茶(CamelliaoleiferaAbel)，为山茶科山茶属，常绿小乔木或灌木，是我国特有的多年生木本油料作物。在优化的工艺条件下，可从油茶饼粕、油茶果壳、油茶籽壳中分别提取11.29%[4]、5.42%[5]、0.27%[6]的多糖。油茶饼粕多糖具有抗氧化、抗肿瘤、降血糖等功能[7-9]。油茶饼粕作为油茶籽榨油的副产物，年产量约40万t[7]，而目前国内大部分油茶饼粕被用作肥料及饲料的原材料。分析油茶饼粕多糖的组成，对进一步研究油茶饼粕多糖的性质、结构、构效关系及生物活性等具有重要的意义，有利于促进油茶饼粕的高效利用，延长油茶加工产业链。

多糖的组成分析一般需先将多糖水解成单糖，再利用薄层色谱[10]、气相色谱[11]、液相色谱[12]等方法对单糖进行分离分析。在液相色谱法中，可用C18柱[13]、氨基(NH2)柱[14]、离子交换柱[15]、糖分析柱[16]等进行单糖分离，再用蒸发光散射检测器(ELSD)[17]、示差折光检测器(RID)[18]、紫外检测器(UV)[13]、串级质谱检测器(MS/MS)[14]等进行检测。NH2柱是利用柱上氨丙基与单糖分子的—OH的氢键强度不同，实现对不同单糖的分离；非极性的C18柱对单糖的保留较弱，但单糖经1-苯基-3-甲基-5-吡唑啉酮(PMP)衍生化后极性降低，故可利用C18柱分离。RID检测利用了单糖分子折光活性；单糖本身虽不产生紫外吸收信号，但其PMP衍生化产物具有生色团，故可用UV检测；MS/MS适用范围广，灵敏度高，也可应用于单糖分析。

本研究首次对比了3种分析油茶饼粕多糖组成的高效液相色谱方法，即NH2柱-RID法、NH2柱-MS/MS法和PMP柱前衍生-C18柱-UV法，并对优选的PMP柱前衍生-C18柱-UV法进行分析方法验证，以期为油茶饼粕多糖的定量分析及高值开发利用提供科学依据，以利于油茶产业的综合发展。

1 材料与方法

1.1 实验材料

1.1.1 原料与试剂

油茶饼粕多糖样品，由广东省林业科学研究院油茶研究团队提供，已经脱蛋白、脱色素处理。乙腈(色谱纯)，欧普森试剂；1-苯基-3-甲基-5-吡唑啉酮(PMP)，麦克林试剂；葡萄糖(Glc)，国药试剂；阿拉伯糖(Ara，98%)、甘露糖(Man，98%)、半乳糖(Gal，99%)、鼠李糖(Rha，98%)、木糖(Xyl，99%)、葡萄糖醛酸(GlcUA，98%)、半乳糖醛酸(GalUA，97%)，源叶生物科技有限公司；硫酸、氢氧化钠、磷酸二氢钾、三氯甲烷均为分析纯，广州化学试剂厂；超纯水，由Synergy UV纯水系统(德国默克密理博公司)制备。

1.1.2 仪器与设备

LC-30AD高压泵、SPD-20A紫外检测器、CTO-30A柱温箱、RID-10A示差折光检测器、LCMS 8040三重四极杆液质联用仪，日本岛津公司；CO-1000柱温箱，武汉恒信世纪科技有限公司；SHA-C水浴恒温振荡器，常州澳华仪器有限公司；DHG-9245A电热鼓风干燥箱，上海一恒科学仪器有限公司；0.22 μm聚砜醚(PES)针式过滤器，天津市津腾实验设备有限公司。

1.2 实验方法

1.2.1 混合标准溶液配制及分析

分别准确称取鼠李糖、木糖、阿拉伯糖、甘露糖、葡萄糖、半乳糖、葡萄糖醛酸、半乳糖醛酸的标准品，用去离子水溶解配制成单标溶液。取适当体积的若干种单标溶液混合，配制成混标溶液。分别采用NH2柱-RID法、NH2柱-MS/MS法及PMP柱前衍生-C18柱-UV法进行分析。

1.2.2 NH2柱-RID法分析

取一定质量浓度的混标溶液直接进样分析。色谱条件：InertSustain NH2分析柱(250 mm×4.6 mm×5 μm，岛津技迩)，柱温35℃，进样量10 μL，流动相为水-乙腈(体积比20∶80)，流速1.4 mL/min。

1.2.3 NH2柱-MS/MS法分析

取一定质量浓度的混标溶液直接进样分析。色谱条件：InertSustain NH2分析柱(250 mm×4.6 mm×5 μm，岛津技迩)，InertSustain NH2保护柱(10 mm×4.0 mm×5 μm，岛津技迩)，柱温35℃，进样量2 μL，流动相为水-乙腈(体积比20∶80)，流速1.1 mL/min(柱后连接三通，进MS流速约为0.4 mL/min)。

质谱条件：电喷雾离子源，脱溶剂管温度150℃，加热块温度450℃，离子源电压-3.5 kV，雾化气流速2.5 mL/min，干燥气流速10 L/min，负离子多反应监测模式(MRM)(具体条件见表1)。

表1 NH2柱-MS/MS法分析单糖的MRM条件

1.2.4 PMP柱前衍生-C18柱-UV法

取一定质量浓度的混标溶液，按参考文献[13,19]进行衍生化。具体如下：取40 μL待测样品于1.5 mL聚丙烯离心管中，依次加入0.5 mol/L PMP甲醇溶液50 μL和0.3 mol/L氢氧化钠溶液50 μL，涡旋混匀后置于70℃烘箱中，反应1 h后取出，冷却至室温。再加入0.3 mol/L盐酸溶液50 μL，混匀后用1 mL三氯甲烷萃取，小心弃去有机层，重复3次。加入100 μL去离子水，混匀后用0.22 μm PES针式过滤器过滤，待高效液相色谱分析。

色谱条件：InertSustain C18分析柱(250 mm×4.6 mm×5 μm，岛津技迩)，InertSustain C18保护柱(10 mm×4.0 mm×5 μm，岛津技迩)，柱温35℃；检测器波长250 nm；进样量15 μL；流速1.0 mL/min；流动相A为乙腈-0.5 mol/L磷酸缓冲溶液(KH2PO4-NaOH，pH 6.9)(体积比15∶85)，流动相B为乙腈-0.5 mol/L磷酸缓冲溶液(KH2PO4-NaOH，pH 6.9)(体积比40∶60)，梯度见表2。

表2 PMP柱前衍生-C18柱-UV法分析单糖的流动相梯度

1.2.5 油茶饼粕多糖样品分析

取0.250 g多糖样品，加入约60 mL 2 mol/L稀硫酸，120℃加热水解4 h，冷却至室温，上清液加0.2 mol/L氢氧化钠溶液调节至pH约为7，并用超纯水定容至50 mL。按照1.2.4步骤进行衍生化和分析。

2 结果与讨论

2.1 3种高效液相色谱法(HPLC)的单糖混标分析结果

2.1.1 NH2柱-RID法

实验结果显示，2种糖醛酸具备折光信号，这与文献[20]报道相符。但采用NH2柱-RID法检测时，糖醛酸并未出峰，这可能与流动相pH、组成等因素有关[21-22]。对鼠李糖、木糖、阿拉伯糖、甘露糖、葡萄糖、半乳糖的混标溶液(质量浓度均为10 g/L)进行检测，HPLC谱图如图1所示。

注：1.鼠李糖;2.木糖;3.阿拉伯糖;4.甘露糖;5.葡萄糖;6.半乳糖。

由图1可知，目标物质在8 min内出峰。该法具备不需对多糖水解产物进行再处理、分析时间短的优点，已被应用于测定谷物类、乳制品、果蔬制品、蜂蜜、糖浆、饮料等食品中果糖、葡萄糖、蔗糖、麦芽糖和乳糖含量的国家标准中[23]，但未能将油茶饼粕多糖中的2种目标戊糖(木糖、阿拉伯糖)和3种目标己糖(甘露糖、葡萄糖、半乳糖)完全分开。由于采用RID，因此也无法进行梯度淋洗以获得更好的分离度，且信号受柱温和流动相流速影响较大。以3倍信噪比计算，6种单糖的检出限在4 823～9 846 ng，灵敏度较低。此外，单糖中的羰基可能与色谱柱固定相中的—NH2发生反应生成席夫碱[24]，导致柱效降低、柱寿命缩短。因此，该法不能满足油茶饼粕多糖的单糖组成分析要求。

2.1.2 NH2柱-MS/MS法

实验结果显示，在优化的MRM条件下，6种单糖和2种糖醛酸均具有质谱响应。但连接上NH2柱时，糖醛酸并未出峰，原因与2.1.1分析的NH2柱-RID法的相同。对鼠李糖、木糖、阿拉伯糖、甘露糖、葡萄糖、半乳糖的混标溶液(质量浓度均为200 mg/L)进行检测，HPLC谱图如图2所示。

由图2可见，目标物质在10 min内出峰。6种单糖的出峰顺序与NH2柱-RID法一致。与RID法相比，由于MRM所选择的离子对不同，因此避免了鼠李糖与其他戊糖、己糖谱图的互相干扰。但2种戊糖(木糖、阿拉伯糖)之间、3种己糖(甘露糖、葡萄糖、半乳糖)之间的分离度仍然没有改善。以3倍信噪比计算，6种单糖的检出限为3.53～8.39 ng，灵敏度较RID法约提高3个数量级。该法与NH2柱-RID法一样，具有不需对多糖水解产物进行再处理、分析时间短的优点，并克服了RID灵敏度低的缺点。缺点是同分异构体之间未能完全分离，糖羰基可能与NH2柱反应导致色谱柱受损。此外，多糖水解产物中的盐或其他杂质可能影响目标物质的离子化效率，并对离子源造成污染，仪器成本和维护成本较高。

注：1.鼠李糖;2.木糖;3.阿拉伯糖;4.甘露糖;5.葡萄糖;6.半乳糖。

2.1.3 PMP柱前衍生-C18柱-UV法

利用PMP柱前衍生-C18柱-UV法对鼠李糖、木糖、阿拉伯糖、甘露糖、葡萄糖、半乳糖、葡萄糖醛酸、半乳糖醛酸的混标溶液(质量浓度均为55 mg/L)进行分离分析，所得HPLC谱图如图3所示。

注：1.甘露糖;2.葡萄糖醛酸;3.鼠李糖;4.半乳糖醛酸;5.葡萄糖;6.半乳糖;7.木糖;8.阿拉伯糖。

由图3可见，在流动相的梯度淋洗下，甘露糖、葡萄糖醛酸、鼠李糖、半乳糖醛酸、葡萄糖、半乳糖、木糖、阿拉伯糖的PMP衍生物在17～35 min依次出峰，13.8 min处的峰归属于残留的PMP。除木糖与阿拉伯糖外，其他4种单糖衍生物均能得到较好的基线分离，分离效果较NH2柱好；8种目标物质的检出限在0.26～4.31 ng，灵敏度高。该法所用的色谱柱和检测器较前两种方法更普遍、易得、易维护。缺点是衍生化步骤较烦琐，衍生化过程中可能导致样品损失或引入杂质，需仔细操作。

3种分析方法的检出限对比见表3。综合比较3种分析方法的灵敏度优缺点，决定采用PMP柱前衍生-C18柱- UV法检测油茶饼粕多糖样品的组成，并对其进行分析方法验证。

表3 3种分析方法的检出限对比 ng

2.2 PMP柱前衍生-C18柱-UV法分析方法验证

2.2.1 线性范围及检出限(LOD)、定量限(LOQ)

配制不同质量浓度的单糖与糖醛酸混标溶液，并按照1.2.4步骤进行分析。以峰面积为纵坐标，质量浓度为横坐标，拟合线性方程，对最低质量浓度的标准溶液逐级稀释、测定，按信噪比分别为3、10计算检出限和定量限，结果见表4。

表4 6种单糖和2种糖醛酸的线性范围、拟合方程、相关系数(r)、检出限(LOD)及定量限(LOQ)

由表4可知，各衍生物峰面积与单糖/糖醛酸质量浓度之间线性良好，线性系数均大于0.99，检出限为0.02～0.29 mg/L，定量限为0.06～0.96 mg/L。

2.2.2 加标回收率和精密度

取一个已知单糖组成的油茶饼粕多糖样品，分别按照50%、100%、150%3个加标水平添加6种单糖和2种糖醛酸的混标溶液，每个水平制备5个平行样。按照1.2.5方法测定，计算加标回收率和精密度，结果见表5。

表5 6种单糖和2种糖醛酸的加标回收率(n=5)

取一个已完成衍生化的样品溶液，在同一天内连续测定6次并计算各组分的保留时间和峰面积的相对标准偏差(RSD)，即得日内精密度。连续6 d测定该溶液，并计算各组分的保留时间和峰面积的RSD，即得日间精密度，结果见表6。8种PMP衍生物的峰面积日间变化见图4。

表6 6种单糖和2种糖醛酸的日内精密度和日间精密度(n=6) %

注：1.甘露糖;2.葡萄糖醛酸;3.鼠李糖;4.半乳糖醛酸;5.葡萄糖;6.半乳糖;7.木糖;8.阿拉伯糖。

由表5可知，6种单糖的加标回收率为77.2%～111.9%，2种糖醛酸的加标回收率偏低，为60.1%～87.0%，可能与糖醛酸分子易发生内酯化有关[25]。

由表6可知，6种单糖保留时间的日内RSD和日间RSD分别为0.08%～0.12%和0.61%～1.04%，峰面积的日内RSD和日间RSD分别为0.08%～3.77%和0.39%～4.38%。其中甘露糖的峰面积精密度较其他5种单糖低(除鼠李糖的日间RSD)，这与所测样品中甘露糖含量较低有关。葡萄糖醛酸和半乳糖醛酸保留时间的日内RSD和日间RSD分别为0.11%、0.12%和1.07%、1.19%，峰面积的日内RSD和日间RSD分别为0.90%、1.83%和17.15%、15.85%。2种糖醛酸的峰面积日内RSD较小，但从2 d开始呈现出峰面积逐渐减小的趋势(见图4)，可能因糖醛酸易发生内酯化而导致衍生化产物不稳定。综上，该方法测定甘露糖、鼠李糖、木糖、阿拉伯糖、葡萄糖、半乳糖6种单糖的精密度高，测定葡萄糖醛酸、半乳糖醛酸时日内精密度高，日间精密度较低。为减小误差，建议糖醛酸的标液现配现用，并在衍生化后的1 d内进行测定。