基质金属蛋白酶⁃9及金属蛋白酶组织抑制剂1在呼吸道合胞病毒毛细支气管炎进展为哮喘中的意义

康平 孙晓敏 赵少聪 冯一川 李奕

郑州大学附属儿童医院1呼吸科，2普内科，3检验科，4过敏原治疗室（郑州450000）

70%以上的毛细支气管炎（以下简称毛支）是由呼吸道合胞病毒（RSV）感染引起的［1］。临床研究证实，婴幼儿时期RSV毛支与儿童时期支气管哮喘的发生密切相关［2-3］，需及早干预以改善预后［4］。临床目前尚缺乏预测毛支进展性哮喘发生的有效指标。基质金属蛋白酶9（matrix metallopro⁃teinase⁃9，MMP⁃9）及其组织抑制剂（tissue inhibitor of metalloproteinase⁃1，TIMP⁃1）是参与呼吸道炎症、哮喘气道高反应性的细胞因子之一［5］，被认为是RSV毛支病情评估的潜在标志物［6-7］。然而，目前关于MMP⁃9、TIMP⁃1及二者平衡状态与RSV毛支发展为哮喘的关系尚未见报道。本研究旨在探讨RSV毛支患儿外周血中MMP⁃9和TIMP⁃1水平在其发展为哮喘中的临床意义。

1 资料与方法

1.1 一般资料收集2015年6月至2017年6月本院收治的RSV毛支患儿300例（RSV组）。纳入标准：（1）症状、体征和相关辅助检查符合《诸福棠实用儿科学》中毛细支气管炎诊断标准［8］，经咽拭子或鼻咽部抽吸等呼吸道分泌物病原学检测明确为RSV感染；（2）30 d～1周岁；（3）首次感染和发病；（4）临床及病史资料完整。排除标准：（1）合并有其他病原体感染；（2）继发于肺结核等肺部感染；（3）合并心脑血管疾病、自身免疫性疾病、肝肾功能障碍；（4）早产儿（胎龄36周）；（5）入组前1个月内使用糖皮质激素。收集同期健康体检幼儿200例为对照组，年龄42 d～1周岁。本研究经郑州大学附属儿童医院伦理委员会批准，相关研究获得受试者家属知情同意。

1.2 临床资料及分组统计研究对象的一般临床资料，包括年龄、性别、过敏史、家族过敏性疾病史、父母吸烟史以及咳嗽、气促、喘息、心动过速、三凹征和发绀等临床查体症状。辅助检查包括呼吸频率、血氧饱和度等。参照RSV毛细支气管炎评分标准（呼吸评分法）对RSV毛细支气管炎患儿进行病情评估［9］。从入组开始对RSV毛细支气管炎患儿进行随访，根据中华医学会儿科学分会呼吸学组制定的诊断标准［10］将RSV毛细支气管炎患儿分为非哮喘组和哮喘组，随访截止至2019年12月。

1.3 实验室指标采集所有研究对象入组时指腹血3 mL，全自动生化分析仪检测血常规指标，观察白细胞计数（white blood cell，WBC）、中性粒细胞计数（neutrophil count，NEUC）及比例、淋巴细胞计数（lymphocyte count，LMC）及比例；放射免疫法测定C反应蛋白（C reactive protein，CRP）；酶联免疫吸附法（enzyme linked immunosorbent assay，ELISA）检测血清中MMP⁃9和TIMP⁃1的含量并计算二者比值：血液样本于非抗凝管中静置2 h，3 000 r/min离心30 min后取上清，按照试剂盒（北京Solarbio科技有限公司）说明书进行操作。

1.4 统计学方法应用SPSS 19.0进行统计学分析。计量资料组间比较行独立样本t检验；计数资料组间比较行χ2检验；采用受试者工作特征曲线（receiver operating characteristic，ROC）分析MMP⁃9、TIMP⁃1和MMP⁃9/TIMP⁃1对RSV毛支诊断及其发展为哮喘的预测价值；logistic多因素回归分析影响RSV毛支发展为哮喘的危险因素。当P ＜0.05时认为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 RSV 组与对照组一般及临床资料比较RSV组NEUT及比例、LMC及比例、CRP显著高于对照组（P ＜0.05）；RSV组血清MMP⁃9、TIMP⁃1水平和MMP⁃9/TIMP⁃1均显著高于对照组（P ＜0.05），见表1。

2.2 MMP-9、TIMP-1 及MMP-9/TIMP-1 与RSV毛支相关性分析以RSV组和对照组作为分类变量进行ROC曲线分析显示，血清MMP⁃9、TIMP⁃1和MMP⁃9/TIMP⁃1诊断RSV毛支的曲线下面积（AUC）分别为0.942、0.579、0.827，最佳截断值分别为1 705.9、115.75 ng/mL和6.57，特异性分别为86.7%、93.0%、91.0%，敏感性分别为90.0%、21.5%、71.0%。见图1。

相关性分析显示，RSV毛细支气管炎患儿MMP⁃9与临床评分呈正相关；MMP⁃9/TIMP⁃1与临床评分及LMC均呈正相关，与NEUT呈负相关（P ＜0.05），提示其与病情严重程度相关。见表2。

2.3 血清MMP-9、TIMP-1 及MMP-9/TIMP-1 与RSV毛支发展为哮喘的关系300例RSV组毛支患儿的随访结果发现，共88例（29.33%）患儿发展为哮喘。比较哮喘组和非哮喘组一般及实验室资料，两组在年龄、接触过敏原、家族过敏史、LMC、呼吸频率、临床评分等指标上差异有统计学意义（P ＜0.05），且哮喘组MMP⁃9水平及MMP⁃9/TIMP⁃1比值均显著高于非哮喘组（P ＜0.05）。见表3。ROC曲线分析显示，血清MMP⁃9、TIMP⁃1及MMP⁃9/TIMP⁃1诊断RSV毛支发展为哮喘的曲线下面积分别为0.612、0.547、0.708，特异性分别为86.3%、75.5%、90.6%，敏感性分别为37.5%、37.5%、61.4%。最佳截断值分别为3 733.7、190.3 ng/mL和14.56。见图2。

表1 RSV 组与对照组一般及临床资料比较Tab.1 Comparison of general and clinical data between RSV group and control group±s

表1 RSV 组与对照组一般及临床资料比较Tab.1 Comparison of general and clinical data between RSV group and control group±s

对照组RSV组t/χ2值P值年龄（d）男［例（%）］接触过敏原［例（%）］家族过敏史［例（%）］父母吸烟［例（%）］WBC（×109/L）NEUT（×109/L）NEUT比例（%）LMC（×109/L）LMC比例（%）CRP（mg/L）氧饱和度（%）呼吸频率（次/min）MMP⁃9（ng/mL）TIMP⁃1（ng/mL）MMP⁃9/TIMP⁃1（n=200）176.9±89.1 113（56.50）43（21.50）49（24.50）83（41.50）8.74±1.21 4.74±1.04 54.3±9.7 3.13±0.91 35.8±9.8 4.56±1.65 96.4±1.3 45.0±7.4 1 115.6±528.0 249.7±132.4 6.1±5.1（n=300）183.1±74.5 187（62.33）49（16.33）55（18.33）120（47.67）8.82±1.79 3.45±1.99 37.7±17.9 4.9±1.49 52.3±17.9 4.93±1.14 96.2±1.3 45.3±7.3 2 776.3±944.9 284.0±131.4 11.4±6.1 0.811 1.701 2.134 2.770 0.112 0.594 9.465 13.375 15.599 13.283 2.762 1.442 0.305 22.609 2.847 10.178 0.418 0.192 0.144 0.096 0.738 0.553＜0.001＜0.001＜0.001＜0.001 0.003 0.150 0.760＜0.001 0.005＜0.001

图1 MMP⁃9、TIMP⁃1 及MMP⁃9/TIMP⁃1 诊断RSV 毛支的ROC 曲线Fig.1 ROC curves of MMP⁃9，TIMP⁃1 and MMP⁃9/TIMP⁃1 in diagnosing RSV bronchiolitis

2.4 RSV 毛支发展为哮喘的危险因素分析以是否发展为哮喘为因变量，纳入表3中P ＜0.05的指标为自变量进行多因素logistic回归分析。结果显示，家族过敏史、临床评分、MMP9及MMP⁃9/TIMP⁃1是RSV毛支向哮喘发展的危险因素，而发病年龄是其保护因素（P ＜0.05）。见表4。

3 讨论

约30% RSV毛支可发展为哮喘，严重者可出现肺部病变甚至心力衰竭［11］。该致病机制尚不明确，目前认为与炎症反应及过度免疫有关。MMPs是降解细胞外基质（ECM）的重要酶类，参与组织重建、修复、血管形成及炎症反应等多种病理生理过程［12］。TIMP⁃1是MMPs的特异性抑制因子，二者共同参与多种呼吸道气道重塑相关疾病［13］。此外，MMP⁃9和TIMP⁃1作为一对互为抑制的分子，二者的平衡在疾病中具有重要意义。NAVRATI⁃LOVA等［14］研究发现，慢性阻塞性肺病（COPD）患者中存在MMP⁃9及TIMP⁃1浓度的显著升高，且患者可能在肺局部及全身水平上存在MMP/TIMP的失衡和紊乱。GILOWSKA等［15］研究也显示，COPD患者血清MMP⁃9和MMP⁃9/TIMP1水平显著高于对照组，且随着患者肺功能的下降逐渐升高。ZHOU等［16］研究显示，MMP⁃9/TIMP⁃1比值的升高与患者的肺功能呈显著负相关关系。有研究显示，COPD患者肺血管中存在MMP⁃9的高表达，且可以介导TLR⁃4的炎症反应以影响肺血管重塑［17］。然而，MMP⁃9和TIMP⁃1在毛支患儿中的表达情况及意义尚不明确。BRAND等［18］的一项前瞻性研究表明，病毒性呼吸道感染儿童血液和鼻咽标本中MMP⁃9的表达水平与疾病的严重性相关，可作为病毒性呼吸道感染疾病严重程度的潜在标志物。本研究发现，与对照组相比，RSV毛支患儿血清MMP⁃9、TIMP⁃1水平及MMP⁃9/TIMP⁃1明显升高，且MMP⁃9/TIMP⁃1与RSV毛支患儿病情严重程度呈明显正相关，提示其可能与RSV毛支的发病及进展相关。

表2 MMP⁃9、TIMP⁃1 及MMP⁃9/TIMP⁃1 与临床评分及血常规指标相关性Tab.2 Correlation of MMP⁃9，TIMP⁃1 and MMP⁃9/TIMP⁃1 with clinical scores and blood routine indicators

表3 哮喘组与非哮喘组一般及临床资料比较Tab.3 Comparison of general and clinical data between asthma group and non⁃asthma group ±s

表3 哮喘组与非哮喘组一般及临床资料比较Tab.3 Comparison of general and clinical data between asthma group and non⁃asthma group ±s

年龄（d）性别（男/女）接触过敏原［例（%）］家族过敏史［例（%）］父母吸烟［例（%）］WBC（×109/L）NEUT（×109/L）NEUT比例（%）LMC（×109/L）LMC比例（%）CRP（mg/L）氧饱和度（%）呼吸频率（次/min）临床评分（分）MMP⁃9（ng/mL）TIMP⁃1（ng/mL）MMP⁃9/TIMP⁃1非哮喘组（n=212）190.9±71.9 133/79 28（13.2）29（13.7）78（36.8）8.76±1.78 3.53±1.96 38.7±17.5 4.36±1.42 51.32±17.53 1.90±1.17 96.20±1.36 44.85±7.14 2.38±0.80 2 747±953 290.3±128.9 10.7±4.9哮喘组（n=88）164.3±77.7 54/34 21（23.9）26（29.5）42（47.7）8.98±1.80 3.28±2.06 35.2±18.7 4.81±1.61 54.81±18.66 1.99±1.06 96.18±1.31 46.41±7.39 3.07±0.92 3 334±1445 268.7±136.9 14.5±5.8 t/χ2值2.858 0.050 5.167 10.456 3.098 0.989 0.994 1.541 2.291 1.541 0.610 0.123 1.706 6.153 3.504 1.297 5.473 P值0.005 0.823 0.023 0.001 0.078 0.323 0.321 0.124 0.023 0.124 0.543 0.902 0.089＜0.001 0.001 0.196＜0.001

图2 MMP⁃9、TIMP⁃1 及MMP⁃9/TIMP⁃1 预测RSV 毛支进展为哮喘的ROC 曲线Fig.2 ROC curves of MMP⁃9，TIMP⁃1 and MMP⁃9/TIMP⁃1 predicting the progression of RSV bronchiolitis to asthma

表4 RSV 毛细支气管炎发展为哮喘的logistic 回归分析Tab.4 Logistic regression analysis of RSV bronchiolitis progressing to asthma

现有研究表明，MMP⁃9与TIMP⁃1共同参与细胞外基质的降解从而影响哮喘发生的关键环节——支气管组织破坏和修复［19］。NAIK等［20］发现哮喘患者诱导痰液中MMP⁃9水平显著高于对照组，提示MMP⁃9与哮喘的发生有关；CHAUHAN等［21］发现在慢性哮喘患者中，MMP⁃9及TIMP⁃1活性均随着气道炎症和肺纤维化的进展而升高，随其缓解而降低。GRZELA等［22］研究认为MMP⁃9在哮喘的病理机制中发挥了重要作用，对MMP⁃9抑制的研究有望成为提高哮喘治疗效果的新视角。本研究结果显示，发展为哮喘的RSV毛支患儿血清MMP⁃9水平及MMP⁃9/TIMP⁃1明显高于非哮喘组，提示该指标可能对RSV毛支向哮喘转化具有一定预测效能，与现有结论基本一致。此外，MMP⁃9/TIMP⁃1与RSV患儿的淋巴细胞及中性粒细胞水平密切相关，提示其可能还参与患儿的炎症及免疫反应过程。因此可以推测，RSV感染诱发哮喘的机制之一可能在于感染诱导气道内炎性因子释放，激活机体免疫反应的同时进一步诱导气道上皮细胞外基质降解，导致气道黏膜上皮完整性的破坏以及严重时哮喘的发生，因此，表征胞外基质降解水平的MMP⁃9/TIMP⁃1指标可以对哮喘的发生起到预警作用。此外，本研究结果还显示，年龄依赖的免疫能力、遗传因素、个体特应性体质及首次发病的严重程度等均是毛支患儿发展为哮喘的影响因素，与现有研究［23］一致。

综上所述，本研究认为RSV毛支患儿血清MMP⁃9、TIMP⁃1水平和MMP⁃9/TIMP⁃1与病情严重程度有关，且MMP9及MMP⁃9/TIMP⁃1可能是RSV毛支发展为哮喘的预后因素，可以作为RSV毛支患儿临床诊疗的参考指标。