淫羊藿次苷Ⅱ对舌鳞状细胞癌上皮⁃间质转化的抑制作用

莫志洋 李英 韩晓东 王虹霞 翁巧凤

青海省人民医院1颌面整形外科，2麻醉科（西宁810008）；3青海大学附属医学院口腔科（西宁810001）

舌鳞状细胞癌（tongue squamous cell carcinoma，TSCC）是常见的口腔恶性肿瘤，发病率、病死率均较高［1-2］。上皮⁃间质转化（epithelial mesenchymal transition，EMT）是肿瘤转移、侵袭的起始步骤，与口腔鳞癌、喉癌、乳腺癌等恶性肿瘤发展过程密切相关［3-5］。淫羊藿次苷Ⅱ（icariside Ⅱ，ICSⅡ）是中药淫羊藿主要提取物，可增强免疫功能、延缓衰老、调节骨代谢，抗肿瘤作用显著。目前，临床对ICS Ⅱ的探索多围绕骨髓间充质干细胞成骨性分化、肿瘤细胞增殖等方面［6-7］，鲜有关于其对TSCC EMT作用的研究。近年来有研究表明［8-9］，Notch1/PTEN/FAK信号传导途径的异常激活是肿瘤形成机制之一，且参与调节多种组织细胞的生长、分化、凋亡，但关于该通路在TCSS EMT中的作用研究尚少。鉴于此，本研究将探讨ICSⅡ对TSCC细胞EMT影响，并探究其通过Notch1/PTEN/FAK通路的调控机制。现报道如下。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 细胞TSCC细胞Tca⁃8113，购自中国医学科学院肿瘤细胞库。

1.1.2 药物、主要试剂、主要仪器淫羊藿次苷Ⅱ（上海纯优生物科技有限公司，纯度＞98%），胎牛血清、RPMI⁃1640培养基（美国Amresco公司），四氮唑盐（microculture tetrozolium，MTT）溶液、二甲基亚砜（dimethyl sulfoxide，DMSO）（美国Sigma公司），吉姆萨（Giemsa）染色液（南京亿迅生物科技有限公司），BCA蛋白定量试剂盒（日本Takara公司），兔抗人Notch1、PTEN、FAK、磷酸化FAK（p⁃FAK）单抗（美国Abcam公司），辣根过氧化酶标记的二抗（上海合星生物科技有限公司）。

NIB900⁃FL型倒置荧光显微镜（德国Leica公司），SpectraMax iD3酶联免疫检测仪（美谷分子仪器（上海）有限公司），Transwell小室（北京优尼康生物科技有限公司），TY⁃80电泳仪（南京普阳科学仪器研究所），Fluor Chem FC2凝胶成像系统（美国Bio⁃rad公司）。

1.2 方法

1.2.1 细胞培养、干预RPMI⁃1640培养基（含10%胎牛血清），37 ℃、5 % CO2培养箱常规培养Tca⁃8113细胞，隔天换液，倒置显微镜观察细胞生长状态，待贴壁80%左右，胰酶消化调整密度传代。取对数期细胞分装至96孔板，200 μL/孔，设为空白组，ICS Ⅱ低、中、高剂量组，每组5个复孔，至细胞再次贴壁80%左右，加入不同浓度ICS Ⅱ，使各孔终浓度分别为12.5、25、50 μmol/L，空白组加入等量PBS处理，继续常规条件培养。

1.2.2 细胞增殖抑制率测算MTT法：取各组干预24、48、72 h的Tca⁃8113细胞，弃去旧培养基后将新制备MTT溶液（浓度为5 μg/μL）滴入每孔中，20 μL/孔，于37 ℃、5%二氧化碳培养箱中培养4 h，弃去上层培养液，每孔加入DMSO溶液，100 μL/孔，充分震荡30 min后采用酶联免疫检测仪测定570 nm处吸光度（A）值，计算细胞增殖抑制率（%）=（A空白组⁃A剂量组）/A空白组×100%。重复3次取均值。

1.2.3 细胞迁移能力测定划痕试验：取各组干预48 h的Tca⁃8113细胞，胰酶消化，重悬，重新调整密度至2.0 × 104个/mL，接种于6孔板，孵育24 h待细胞铺满后弃去培养基。采用2 μL移液器枪头沿单层细胞划过，PBS轻吹去除细胞碎片，置入完全培养基继续孵育24 h后。采用显微镜观察，计算细胞迁移率（%）=（初始划痕宽度—测量时划痕宽度）/初始划痕宽度×100%。

1.2.4 细胞侵袭能力测定Transwell小室试验：取各组干预48 h的Tca⁃8113细胞，调整细胞密度为2.0 × 105个/mL的细胞悬液，取200 μL接种于Transwell小室（24孔趋化板，孔径8 μm）上室，下室中加入含10%胎牛血清培养基，孵育24 h擦去上室细胞，采用预冷PBS溶液冲洗，10%甲醛固定15 min，Giemsa染色后取少量悬液置于计数板中，显微镜观察穿膜细胞数量。

1.2.5 细胞中Notch1、PTEN、FAK、p-FAK 蛋白相对表达量Western blot法：取各组干预72 h的TSCC细胞，冰上裂解，12 000 r/min离心15 min（离心半径为8 cm），BCA试剂盒定量蛋白。取30 μg样品与上样缓冲液混合，凝胶电泳30 min，电转45 min，加入5%脱脂奶粉封闭液封闭2 h，加入一抗（1∶1 000）于4 ℃孵育过夜，TBTS冲洗，加入辣根过氧化物酶标记二抗（1∶10 000），常温孵育2 h，TBTS冲洗。20 min内曝光、显影。采用凝胶成像系统扫描，以Notch1、PTEN、FAK、p⁃FAK蛋白灰度值/内参β⁃actin灰度值表示蛋白相对表达量，计算p⁃FAK/FAK。

1.3 统计学方法采用SPSS 26.0统计学软件分析，计量资料以均数±标准差表示，多样本计量资料以方差分析检验，以SNK⁃q检验分析两两样本。P ＜0.05差异有统计学意义。

2 结果

2.1 各组增殖抑制率增殖抑制率组间比较，差异有统计学意义（P ＜0.05）；ICS Ⅱ低、中、高剂量组24、48、72 h增殖抑制率均呈上升趋势（P ＜0.05）；随时间延长各组增殖抑制率呈上升趋势（P ＜0.05）。见表1。

表1 各组增殖抑制率Tab.1 Comparison of proliferation inhibition rate in each group ±s，%

表1 各组增殖抑制率Tab.1 Comparison of proliferation inhibition rate in each group ±s，%

注：与ICS Ⅱ低剂量组比较，aP ＜0.05；与ICS Ⅱ中剂量组比较，bP ＜0.05；与24 h 比较，cP ＜0.05；与48 h 比较，dP ＜0.05

组别ICSⅡ低剂量组ICSⅡ中剂量组ICSⅡ高剂量组F 值P 值24 h 17.45±2.17 20.35±3.84a 24.91±3.97ab 6.024 0.015 48 h 21.30±3.87c 26.02±3.95ac 31.63±4.01abc 8.597 0.005 72 h 27.61±3.90cd 32.76±4.29acd 38.71±5.01abcd 7.883 0.007

2.2 各组迁移能力空白组，ICSⅡ低、中、高剂量组迁移率分别为（86.14±9.11）%、（72.62±7.45）%、（60.91 ± 8.14）%、（33.86 ± 5.16）%，迁移率组间比较，差异有统计学意义（F=42.669，P ＜0.001）；空白组大于ICSⅡ低、中、高剂量组（t=2.569，P=0.033；t = 4.618，P = 0.002；t = 11.166，P ＜0.001）；ICSⅡ低剂量组大于ICSⅡ中、高剂量组（t = 2.373，P =0.045；t = 9.564，P ＜0.001），ICSⅡ中剂量组大于ICSⅡ高剂量组（t=6.276，P ＜0.001）。见图1。

图1 划痕试验结果（×100）Fig.1 Scratch test results（×100）

2.3 各组侵袭能力空白组，ICS Ⅱ低、中、高剂量组每个视野穿膜细胞数分别为（119.86 ± 27.09）、（98.74±18.92）、（40.30±7.35）、（19.10±4.27）个，穿膜细胞数组间比较，差异有统计学意义（F = 38.851，P ＜0.001）；空白组多于ICS Ⅱ低、中、高剂量组（t=2.469，P=0.039；t=6.338，P ＜0.001；t=8.216，

P ＜0.001）；ICS Ⅱ低剂量组多于ICS Ⅱ中、高剂量组（t=6.438，P ＜0.001；t=9.181，P ＜0.001），ICS Ⅱ中剂量组多于ICS Ⅱ高剂量组（t=5.577，P=0.001）。见图2。

图2 Transwell 小室试验结果（×100）Fig.2 Transwell chamber test results（×100）

2.4 各组Notch1、PTEN蛋白相对表达量及p-FAK/FAKNotch1、PTEN蛋白相对表达量及p⁃FAK/FAK比较，差异有统计学意义（P ＜0.05）；空白组，ICS Ⅱ低、中、高剂量组Notch1蛋白相对表达量及p⁃FAK/FAK呈降低趋势（P ＜0.05），PTEN蛋白相对表达量呈升高趋势（P ＜0.05）。见表2、图3。

3 讨论

TSCC是起源于舌复层鳞状上皮的头颈部恶性肿瘤，恶性程度高、浸润性强，病灶可浸润口腔颌面部、颈部重要组织结构，导致血管破裂、疼痛、张口受限等［10］。目前手术切除、放疗、化疗等综合疗法治疗TSCC可获取一定效果，但远期生存率并不理想［11］。研究［12］认为，肿瘤远处转移及局部侵袭是其恶性特征的主要表现，且是导致TSCC预后不良的重要因素，而EMT是该过程中的重要环节。因此，抑制EMT是改善TSCC预后、延长其生存期限的关键。近年来，随着对传统中药开发、应用力度的逐渐加大，从天然植物中提取化合物治疗肿瘤已成为临床研究热点。淫羊藿是小檗科淫羊藿属多年生草本植物，具有促进精液分泌、降压、降糖、利尿、抗肿瘤、抗衰老及增强造血功能和免疫功能等功效［13］。ICSⅡ提取自淫羊藿，其抗肿瘤作用近年来备受关注。

表2 各组Notch1、PTEN 蛋白相对表达量及p⁃FAK/FAKTab.2 Comparison of relative expression of Notch1 and PTEN protein and p⁃FAK/FAK in each group ±s

表2 各组Notch1、PTEN 蛋白相对表达量及p⁃FAK/FAKTab.2 Comparison of relative expression of Notch1 and PTEN protein and p⁃FAK/FAK in each group ±s

注：与空白组比较，aP ＜0.05；与ICS Ⅱ低剂量组比较，bP ＜0.05；与ICS Ⅱ中剂量组比较，cP ＜0.05

组别空白组ICSⅡ低剂量组ICSⅡ中剂量组ICSⅡ高剂量组F 值P 值Notch1 0.85±0.08 0.69±0.07a 0.44±0.04ab 0.21±0.02abc 118.935＜0.001 PTEN 0.22±0.03 0.41±0.05a 0.68±0.07ab 0.80±0.08abc 93.367＜0.001 p⁃FAK/FAK 0.84±0.09 0.58±0.06a 0.37±0.04ab 0.15±0.02abc 126.764＜0.001

图3 蛋白免疫印记图Fig.3 Immuno⁃imprint of protein

本研究结果显示，ICSⅡ低、中、高剂量组增殖抑制率依次升高；空白组、ICSⅡ低、中、高剂量组迁移率依次降低，每个视野穿膜细胞数依次减少，提示ICS Ⅱ可抑制TSCC细胞增殖，降低其迁移、侵袭能力，且呈剂量依赖。ICS Ⅱ属淫羊藿黄酮苷类化合物，可抑制骨质疏松、保护神经系统，且在宫颈癌、肝癌中均表现出良好的抗肿瘤作用［14-15］。NI等［16］采用菌落形成、Transwell小室试验及迁移测定等方式发现，ICSⅡ可通过影响细胞内能量代谢，诱导癌细胞凋亡，降低其迁移、侵袭能力，与本研究结论相似，但本研究采用不同剂量ICSⅡ进行研究，更具说服力。SONG等［17］在探究ICS⁃Ⅱ对A549、H1299细胞迁移能力的影响中发现，ICS⁃Ⅱ可抑制由炎症因子诱导的EMT及癌细胞侵袭。本研究采用ICSⅡ干预TSCC细胞后，细胞增殖受到抑制，且迁移、侵袭能力降低，可能与其抑制该肿瘤EMT程序信号、调控相关基因表达有关。

此外，本研究中，ICSⅡ低、中、高剂量组Notch1蛋白及p⁃FAK/FAK呈降低趋势，PTEN蛋白呈升高趋势，推测ICSⅡ可能通过调控Notch1/PTEN/FAK信号通路，抑制TSCC细胞EMT，且呈剂量依赖性。Notch1通路是广泛参与细胞分化、发育、调控的重要信号途径，在不同肿瘤中发挥促癌或抑癌作用，甚至在同一肿瘤的不同阶段可发挥相反的生理作用［18-19］。LIU等［20］认为，Notch1基因在TSCC中异常高表达，采用Notch通路抑制剂DAPT可抑制TSCC细胞侵袭及转移。PTEN是最早发现的具有蛋白磷酸酶、脂质磷酸酶双重活性的抑癌基因，可通过多条通路调控肿瘤生物学行为［21］。Notch1基因可能通过负性调控PTEN参与TSCC疾病进程。FAK是位于胞质的酪氨酸蛋白激酶，可通过促使细胞增殖从而激发细胞侵袭性生长。PTEN可通过降低FAK酪氨酸磷酸化水平，减少肌动蛋白纤维数量、减弱细胞运动能力，抑制肿瘤黏附性生长，从而抑制肿瘤细胞增殖、迁移、侵袭［22］。本研究应用不同浓度ICSⅡ干预TSCC细胞，可能通过抑制Notch1表达及FAK磷酸化，上调PTEN而影响肿瘤细胞生长，降低其迁移、侵袭能力。

综上所述，ICSⅡ可抑制TSCC细胞增殖、迁移、侵袭能力，且呈明显剂量依赖性，推测其可能通过下调Notch1表达、上调PTEN表达、抑制FAK磷酸化发挥抗TSCC作用。基于ICSⅡ、Notch1/PTEN/FAK通路在TSCC治疗中的作用，不仅为TSCC药物的研发提供了更多的方向与思路，还为ICSⅡ应用于TSCC的控制提供了更多理论依据。然而，ICSⅡ对Notch1/PTEN/FAK信号传导途径下游信号分子的影响如何，以及作用于TSCC时是否存在其他调控机制尚未明确，这也将是下一步的研究方向。