GOLM1通过调节MMP13促进胃癌转移

李现民，曹丽丽

（山东省安丘市人民医院，山东 安丘 262100）

胃癌（GC）在中国导致大量癌症诱发的死亡，尽管手术切除仍然是GC患者的有效治疗方法，但由于原发性癌细胞的局部扩散和远处转移，在治疗后仍可能出现癌症的复发和转移[1]。因此，深入研究GC形成背后的精确分子机制对于开发GC的分子标志物和治疗策略很重要。本文进一步阐明GC细胞转移特性背后的分子机制，为优化GC治疗方案提供理论依据，现报道如下。

1 资料与方法

1.1 研究背景

转移性胃癌是一种典型的难治性疾病。抗转移治疗的进展受到阻碍，因为调控GC细胞转移的潜在机制没有得到很好的阐明。

1.2 方法

1.2.1 样本获得

从2000年至2010年在安丘市人民医院临床诊断出的患者中获得了三十对胃癌（GC）组织和相应的正常组织。研究事先获得患者的同意，并且得到了机构研究的授权，经安丘市人民医院伦理委员会通过。

四种GC细胞系（MKN45，MKN28，SGC7901和BGC823），HEK-293T细胞和人胃上皮细胞（GES-1）购自广州珍妮生物技术有限公司。将细胞系维持在37℃的5%CO2培养箱中。

1.2.2 转染

用Lipofectamine 3000进行载体或短发夹RNA的转染。

1.2.3 细胞增殖测定

SGC791或BGC823细胞接种到96孔板中。将细胞培养24小时，48小时或72小时后，通过MTS细胞增殖比色测定试剂盒在490nm处测定OD值[2]。

1.2.4 集落形成分析

SGC7901细胞在六孔板中培养，并与新鲜培养基孵育两周，之后用4%甲醛固定细胞集落，并用1%结晶紫染色。

1.2.5 迁移测定

将SGC7901或BGC823细胞接种到六孔板中，使其融合过夜，使用100μl尖端制造人工伤口；后使用不含FBS的培养基培养细胞24小时，在0 h和24 h记录伤口宽度的图像[3]。

1.2.6 Transwell入侵检测

将细胞悬浮于无血清培养基中，并添加到Transwell滤膜的上腔室中；在下腔室中装满600μl含20%FBS的培养基，孵育24小时后，使用4%甲醛固定侵袭的GC细胞，并在随机选择的五个电场中对侵袭的细胞数进行计数[4]。

使用TRI试剂收集总RNA。使用PrimeScript RT试剂盒用1 g R N A合成c D N A。使用S Y B R P r e m i x Ex Taq在Applied Biosystems中进行qPCR13反向：CTG TGGAGGTC ACTGTAGAC T，GAPDH向前：A G G T C G G T G T G A A C G G AT T T G，G P P D H反向：GGGGGTGTTGATGGCAACA。

1.2.7 免疫印迹分析

使用RIPA裂解法从细胞或组织中收集蛋白质。25%的蛋白质使用8%SDS-PAGE分离并转移至PVDF膜上；将PVDF膜与MMP13，GOLM1或GAPDH抗体）孵育过夜，或将GAPDH抗体孵育过夜。用TBST洗涤3次后，将PVDF膜与结合了HRP的二抗一起孵育。使用ECL试剂盒检测目标条带。

1.2.8 异种移植模型

将亲代SC7901细胞或shGOLM1转染的SGC7910细胞或GOLM1过表达的SGC7901细胞皮下接种到BALB / c裸鼠中。每周测量其宽度和长度，并计算每组的肿瘤体积。四周后将裸鼠杀死，通过侧尾静脉将过表达的SGC7901细胞注入裸鼠，14天后，将裸鼠献血并转移灶数，在肺组织中计数。

1.3 统计学方法

所有数据均以均值SD表示，并使用SPSS 17.0软件（IBM，Chicago，IL，USA）进行了分析。使用学生t检验对正态分布数据进行分组比较。P＜0.05被认为具有统计学意义。

2 结 果

在本研究中，我们发现GOLM1在气相色谱中过度表达，敲除GOLM1可降低体外气相色谱细胞的侵袭性表型。此外，GOLM1的下调抑制了裸鼠GC细胞的生长。然而，GOLM1的上调明显提高了GC-SGC7910细胞的生长、迁移和侵袭能力。最后，GOLM1以MMP13依赖的方式增加GC细胞的转移表型。

3 结 语

恶性胃癌（GC）是具有高转移潜力的常见消化系统肿瘤，具有最高的死亡风险，因此，胃癌转移机制的研究对于改善胃癌的治疗至关重要[5]。在本研究中，我们揭示了GOLM1在GC细胞生长和转移中的关键功能，观察到GOLM1在体外调节GC细胞的侵袭性表型（迁移和侵袭），在体内调节GC细胞的生长。另外，我们观察到了qLC和免疫荧光染色测定法在临床GC组织以及GC细胞系中GOLM1的过度表达，但是GOLM1到底如何调节GC的侵略性行为仍然没有很好的探索。先前的报道证实，间充质型癌细胞表现出更高水平的基因，这些基因与侵袭和迁移行为有关[6]。GOLM1对癌细胞EMT的调节功能可能通过几种途径来执行，包括直接调节EMT过程所需的EMT转录因子或细胞结构成分，在未来的研究中有必要阐明GOLM1在GC细胞EMT过程中的确切作用。

总之，我们的研究确定GOLM1是胃癌发展过程中的关键调节剂，这表明GOLM1可能是对抗人类胃癌转移的有希望的新治疗靶标。