结核病实验室诊断技术研究进展

白 云，安黎云

结核病是由结核分枝杆菌（mycobacterium tu⁃ber⁃culosis， MTB）经呼吸道传播而引起的全身性慢性传染病，又被称为“白色瘟疫”［1］。 结核病是由单一致病菌引起的病死率最高的且是人类发展史最长的一种疾病，是全世界公共卫生领域面临的最严峻挑战［2］。 据WHO 统计，全球每年死于结核病的人数高达300 万人，我国结核病发病率高达99／10 万人，是全球27 个耐多药结核病、22 个结核病高感染率国家之一［3］。 同时由于艾滋病的流行、结核杆菌耐药性的增强和多重耐药菌株的出现、痰菌阳性结核病患者管理措施不当，致使我国结核病防治工作非常严峻［4］。 另外由于实验室检测环节的薄弱，传统检测方法存在灵敏度低、检测时间长、阳性率低等不足，也一定程度制约了结核病的尽早诊断和治疗［5］。 肺外结核由于结核杆菌数量较少，且由于深部器官结核病灶标本不易获取，也需要更快速、更可靠的实验室诊断方法［6⁃7］。 因此结核病的快速诊断新技术必将成为全球结核病研究和防控的优先发展领域。 从100 多年前德国科学家Robert Koch 发现MTB，再到结核病细菌学、分子生物学检测技术的发展，可以说结核病的发展史就是一部结核病临床诊治史，实验室诊断在结核病的预防控制、诊断、治疗过程中发挥着重要作用，是检出致病菌、确诊及选择治疗方案的主要手段，也是评估治疗效果的有效方法［8］。 本文就以下几个方面对我国结核病实验室诊断技术的应用进展阐述如下。

1 MTB 培养和药物敏感试验（药敏试验）

1.1痰涂片萋－尼染色镜检法 痰涂片萋－尼染色镜检法在结核病的防治工作中应用范围最广泛，优势是操作快速、简便、经济，缺点是灵敏性低，同时假阴性率较高，从而导致结核病的检出率偏低。

1.2液基夹层杯法 液基夹层杯法首先对痰液进行彻底灭活后通过高速离心并加热，将释放出的MTB 集聚在彭氏夹层杯底部的基片上，然后进行萋－尼染色镜检［9］。 有研究发现，将754 份痰标本同时采用直接痰涂片法与液基夹层杯法进行镜检，后者可将阳性检出率提高至23．5%（177／754）［10］。1.3固体及液体培养 MTB 培养是结核病诊断的金标准，MTB 固体培养试验的灵敏度高于MTB 涂片镜检［11］，以Middlebrook 为基础的7HIO 培养基和改良罗氏培养基大多用于固体培养，菌阳性结果需要3～4 周，而菌阴性结果则需要8 周［12⁃13］。 MTB 液体培养法是应用BACTEC MGIT 960 自动化培养系统经测定液体培养基中氧气消耗量来判定MTB 有无生长（即阴阳性），具体试验原理：BACTEC MGIT 960 自动化培养系统的MGIT 培养管底部含有一定量氧淬灭荧光的硅树脂成分，其可使细菌生长过程中吸收弥散的氧气，随之释放二氧化碳，但随氧气进一步消耗，荧光剂不再受抑制，在紫外线照射下培养管便出现荧光，且荧光强度和氧气消耗量呈正比。此液体培养法不仅敏感性较高，同时还可以缩短阳性结果报告时间（4～10 d），可使阴性结果报告时间缩短为42 d；但该方法缺点是对实验室的生物安全级别要求很高，并且试剂完全依赖进口，成本较高，在资源匮乏的国家和地区尚不能大规模普及［14］。同时MTB 培养阳性敏感率仅为45%～80%，且培养周期长，并且要求标本中含有活菌［15］。 但培养时间过长可能延误诊断和治疗，易导致疾病恶化。 另外，临床工作中发现在曾经接受抗结核治疗的患者中，获取含有活菌体液标本非常不易。

1.4耐多药结核病传统实验室诊断方法 药敏试验是耐多药结核病的传统实验室诊断方法，同时也是我国大多数医院常用的诊断方法之一［16］。 该方法存在对实验室要求高、周期长、灵敏度低的缺点，容易导致结核病复发、获得性耐药及切口处窦道、瘘口形成，不利于早期快速诊断［17］。

2 分子诊断方法

21 世纪初随分子生物学技术不断发展，新型分子诊断技术应运而生，因其具有较高的特异性、敏感度而在临床受到极大青睐。 其中尤以MTB 快速分子诊断技术应用广泛，如实时荧光定量聚合酶链式反应、基因芯片技术、核酸线性探针技术、环介导等温扩增技术、交叉引物扩增技术（crossing priming amplification， CPA）及利福平耐药实时荧光定量核酸扩增试验等，现逐一介绍如下。

2.1实时荧光定量聚合酶链式反应 实时荧光定量聚合酶链式反应工作原理是：在聚合酶链式反应体系中分别加入两端标有淬灭、荧光集团的探针［18］，探针序列与扩增处互补形成单链核苷酸序列，扩增后分析熔解曲线同时实时监测荧光值动态变化，经计算温度荧光值和负导数获得探针与该序列杂交产物熔解曲线的熔点（Tm 值），最终经推断该序列基因突变信息，评估MTB 是否对抗结核药物耐药。

2.2基因芯片技术 基因芯片又被称为DNA 芯片、DNA 微阵列和寡核苷酸阵列，该技术是基于MTB 探针对不同抗结核药物基因突变位点的不同，经检测基因突变位点上的DNA 片段来判定MTB 患者是否对抗结核药物耐药，同时各基因突变位点与对应药物耐药性又有一定相关性［19］。 具体试验方法：采用原位合成或显微打印法将DNA 探针固定在支持物表面形成二维DNA 探针序列，后使其与标记物样品进行杂交，经检测杂交信号判断基因突变位点，然后通过分析基因突变位点与抗结核药物耐药性间的关联性，而实现被测样品高效、快速检测［20］。2.3核酸线性探针技术 核酸线性探针技术是结合聚合酶链式反应（PCR）扩增、反向杂交、膜显色技术经引物扩增目的片段，后将扩增产物与膜上所固定的特异性探针进行杂交，经酶显色法判定杂交产物结果从而实现MTB 检测的一种实验室技术［21］。

2.4CPA CPA 是一种新型恒温核酸扩增技术，包含具有置换链功能的嗜热性脂肪芽孢杆菌聚合酶、两条交叉引物和两条扩增引物［22］。 这些寡聚核苷酸链能依靠具有高活性链置换特性的嗜热性脂肪芽孢杆菌聚合酶，使DNA 实现不断的循环扩增，从而确定受检样本中是否含有MTB［23］。 同时CPA 可与核酸试纸检测技术、快速核酸提取技术相结合应用，经多方面临床验证，此方法较传统培养法敏感度和特异度高［24］。

2.5实时荧光核酸恒温扩增技术 实时荧光核酸恒温扩增技术是结合实时荧光检测和核酸恒温扩增技术的一种新型核酸检测技术［25］。 该技术是在同一温度下经拷贝目标病毒反转录酶产生的靶标核酸上一个双链DNA，后利用T7 RNA 多聚酶从该DNA拷贝产生的100～1000 个RNA；每个RNA 拷贝再从反转录开始进入下一扩增循环；同时将带有荧光标记的探针和这些复制RNA 进行特异性结合并产生荧光，再经荧光检测仪实时捕获直观反映扩增循环情况从而到达检测目的［26］。

2.6环介导等温扩增技术 环介导等温扩增技术是利用具有链置换活性的DNA 聚合酶在约65℃条件下完成核酸扩增的反应特点，来检测MTB 目的DNA 片段，从而获得诊断线索的一种检测方法［27］。

2.7利福平耐药实时荧光定量核酸扩增试验 利福平耐药实时荧光定量核酸扩增试验是一种依托于Gene Xpert 平台及realtime．PCR 技术的检测MTB 及利福平耐药的一种方法［28］。 Gene Xpert 平台最初是美国用于快速检测邮政系统含有炭疽病毒邮件的，后拓展用于多种病原微生物及细菌检测。 利福平耐药实时荧光定量核酸扩增试验是以半巢式实时定量PCR 技术为基础，以rpoB 基因为靶基因，扩增其上192 bp 片段DNA 进行检测；因为≥95%的利福平耐药菌株有rpoB 基因变异，同时该区域具有相同核酸序列。 同时使用6 种分子信标来对应检测6 种探针，其中以探针A～E 命名的5 个相互重叠的分子探针选择性覆盖rpoB 基因的81 bp 核心区域，用来检测利福平耐药；另外1 个特异性探针对应球芽孢杆菌作为内参，来判断DNA 扩增率及检测率［29］。此外，大部分利福平耐药菌株同时也会对异烟肼耐药，故其也可作为耐多药结核病的监测指标。 近年来，利福平耐药实时荧光定量核酸扩增试验广泛应用于痰液、临床分离菌株及少数肺外结核标本的MTB 和利福平耐药性检测，具有检测敏感度及特异度高、生物安全性好、操作简便、耗时短等优势［30］，故WHO 将该技术推荐为MTB 分子药敏检测的首选方法。

3 免疫学诊断技术

3.1皮肤结核菌素感染检测 结核菌素试验及后来广泛应用的结核菌素纯蛋白衍生物试验，在结核病尤其是儿童结核病的辅助诊断中发挥重要作用，但因其方法原始并且存在许多弊端，如接种过卡介苗、免疫功能低下患者检测灵敏度和特异度均低，限制了其在结核病诊断中的应用。

3.2γ⁃干扰素（IFN⁃γ）释放试验 近年来，在我国各级实验室陆续开展IFN⁃γ 释放试验，并将其作为确定结核潜伏感染及诊断结核病的主要措施［31］，其主要包括两种方法，现介绍如下。

3.2.1基于全血的酶联免疫吸附试验：经使用MTB 特异性蛋白质的多肽抗原，培养滤液蛋白10和TB7．7 参与全血共同孵育，二者能够刺激感染MTB 者的T 细胞应激发生IFN⁃γ 反应，但是绝大多数的非MTB 及卡介苗菌株都不含有以上蛋白，故未感染者或卡介苗接种及结核潜伏感染者，不会产生相应免疫应答，可经酶联免疫吸附试验检测IFN⁃γ来判断是否存在MTB 特异性细胞免疫反应［32］。

3.2.2基于外周血淋巴细胞的免疫斑点试验：经将外周血淋巴细胞、MTB 特异性混合性抗原A 和B 的多肽片段，与对照试剂混合后放入含抗IFN⁃γ 抗体的微孔培养板内。 当外周血单个核细胞存在MTB特异性T 细胞时，便会刺激培养液中混合抗原A 和B 分泌IFN⁃γ，同时被微孔板抗IFN⁃γ 抗体捕获，后加入碱性磷酸酶标记，并针对不同IFN⁃γ 表位的二抗与被捕获的IFN⁃γ 结合，最终在反应部位显色底物被酶分解成色素沉淀斑点，每个斑点代表1 个MTB 特异效应T 细胞，据斑点数量检测体内含有对MTB 反应的效应T 细胞数量［33］。

3.3T⁃SPOT 释放试验 T⁃SPOT 释放试验是利用酶联免疫吸附试验从单细胞水平来检测细胞因子的免疫技术［34］。 虽然此技术对结核感染的诊断敏感性和特异性较其他方法差，但是其优点在于标本易采集且检测耗时短，特别适用于浆膜腔渗出液、呼吸道分泌物及病灶分泌物等脱落细胞类检测，可作为不易取得标本、菌阴性肺结核、肺外结核、儿童及体弱等特殊群体的辅助诊断手段［35］。 且T⁃SPOT 释放试验可作为利福平耐药实时荧光定量核酸扩增试验、结核菌素－PCR 检测的有效补充，三者联合应用可极大提高肺结核早期诊断率，同时对疾病的控制、传播和预防起到很大的作用。

4 小结

由于耐多药结核菌的流行，人类免疫缺陷病毒感染、器官移植、免疫抑制剂大量不规范使用所导致免疫损害的增多，以及高龄人口免疫力低下等因素，使MTB 感染率日益增高，我国结核病防治工作面临形势非常严峻［36］。 我国结核病实验室诊断体系由三部分组成：第一，以细菌学检查为主要技术手段的国家、省、地（市）和区（县）疾病预防控制机构结核病实验室体系，其中全国约1／3 的区（县）级实验室

已经配备了分子诊断设备；第二，专科医院结核病实验室和结核病定点医院，可开展涂片镜检、药敏试验和分离培养等较全面的细菌学检查，同时开展分子生物学技术及快速培养法对特殊患者进行鉴别诊断；第三，综合医疗机构的结核病实验室，可开展细菌学检查和一些新实验室诊断方法。 目前，第三类医疗机构的结核病实验室正在逐步加入质控体系并越来越规范化。 同时WHO 建议亟须研发更加快速、安全、准确的结核病实验室诊断技术，以应对日益严重的耐多药结核病疫情；应用更多的快速、敏感度和特异度高的结核病实验室诊断新技术及方法，来改善目前诊断方法相对落后的局面。