某养殖场的病死野猪ASFV实时荧光PCR检测

2020-12-11杨娴娟吴永辉杨娴婧

猪业科学 2020年11期

杨娴娟，吴永辉，杨娴婧

（1.甘肃农业大学，甘肃兰州 730070；2.甘肃畜牧工程职业技术学院，甘肃武威 733006；3.哈密市伊州区动物疫病预防控制中心，新疆哈密 839000）

非洲猪瘟(African swine fever，ASF)是由非洲猪瘟病毒(ASFV)引起的猪的一种以高热、皮肤和内脏器官出血、高病死率为主要特征的急性、热性、高度致死性传染病[1]。由于该种病毒性疾病最初发生于非洲肯尼亚，因此被称为非洲猪瘟。该病在OIE中被列为A类动物传染病，我国原农业部在2008年发布的《一、二、三类动物疫病病种名录》中也将其列入了一类动物疫病，是我国重点防范的外来动物疫病之一[2]。目前，全世界尚缺乏有效的疫苗进行免疫预防，各国防疫部门对于该病面临着巨大的防控压力。

据报道，全球已经有60多个国家报道过非洲猪瘟疫情，我国首次报告的非洲猪瘟疫情发生于2018年8月的辽宁沈阳，病情迅速向各个省份传播蔓延，已经给我国整个生猪行业造成了巨大的经济损失。2020年3月，中国农业科学院哈尔滨兽医研究所报道了1株人工缺失7个基因的非洲猪瘟弱毒活疫苗对家猪具有良好的安全性和有效性[3]，但目前仍未见规模生产上市。因此，在疫苗研发上市之前，采用先进、高效的检测方法对非洲猪瘟病毒(ASFV)持续实时监测很有必要。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 血清样本

采用随机抽样的方式采集武威市某野猪养殖场病死猪耳朵（每份血样20～40 mL）和鼻拭子样品各2份，带回实验室，置-20 ℃冰箱中保存备用。采集的样本均详细记录样本来源、猪群阶段等信息。

1.1.2 试剂与仪器

DNA/RNA提取试剂盒和非洲猪瘟病毒实时荧光PCR检测试剂盒均购自洛阳莱普生信息科技有限公司。

试验所需移液枪、超净工作台，实时荧光PCR检测系统等均由武威市牛满加药业有限公司实验室提供。

1.2 方法

1.2.1 样品处理

随机分别从每份猪耳朵的3个不同位置称取少量组织样品（1 g），立刻用手术剪剪碎混匀后称取0.05 g于研钵中研磨，加入1.5 mL的生理盐水后继续研磨。待匀浆后转入1.5 mL无菌离心管中，8 000 r/min离心2 min，取上清至1.5 mL无菌离心管中。

每份鼻拭子样品浸液置于4 ℃冰箱过夜，在旋涡振荡器上震荡5 s，用移液器将鼻拭子浸液全部移入1.5 mL无菌离心管中，10 000 r/min离心5 min，取上清至1.5 mL无菌离心管中。

以上样品均置于60 ℃条件下灭活30 min，转入-20 ℃冰箱中保存备用。

1.2.2 DNA提取和qPCR实验

分别参照DNA/RNA提取试剂盒和非洲猪瘟病毒实时荧光PCR检测试剂盒说明书进行。

qPCR反应体系：20 uL；qPCR反应条件：预变性95 ℃ 30 s，循环95 ℃ 5 s，60 ℃ 40 s，共 40 个循环，在循环第二阶段结束时收集荧光信号。

2 结果判定

2.1 结果有效性

2.1.1 试剂盒有效性判定

阳性对照Ct值≤30，有明显指数增长，呈典型的S型曲线；阴性对照Ct值＞38或无Ct值，线形为直线或轻微斜线，无明显指数增长期和平台期，则实验成立。

2.1.2 样品结果判定标准

阳性：样本检测结果Ct值≤35，有明显指数增长，表明样本中检测出ASFV；

疑似：样本检测结果Ct值在35～38之间，应对样本进行复检，如实验结果Ct值仍在35～38之间，有明显指数增长，则判定为阳性，否则判定为阴性；

阴性：样本检测结果Ct值＞38或无Ct值，表明样本中无ASFV，对于某些未呈S型曲线，但本底较高的样品，亦判定为阴性。

2.2 结果

2.2.1 试剂盒检测结果

由表1和图1可知，2份阳性对照的Ct值分别为22.973和22.785，均小于30；荧光值均呈指数增长，形成典型的S型曲线。2份阴性对照均无Ct值，线形为直线。因此，本实验结果成立。

2.2.2 样本检测结果

由表1和图1可知，猪耳样品和猪鼻拭子样品均无Ct值，线形为直线，表明实验中所有被检测样品均为ASFV 抗原阴性。

3 讨论

目前，全世界范围尚未研制出有效的ASFV疫苗，在非免疫状态下，使用灵敏度高、特异性强、准确性高的实时荧光 PCR技术对ASFV进行检测，是目前非洲猪瘟防控最有效的办法之一。本实验选取临床及病理特征与非洲猪瘟相似的2份野猪耳朵病料和2份野猪鼻拭子进行检测，结果未发现ASFV阳性病例，说明武威市非洲猪瘟防控措施基本到位，未出现缺口。

非洲猪瘟属于外来病，边境地区、生猪养殖贸易、调运活跃区是重点防范地区。本研究针对甘肃省2020年5月分别发生非洲猪瘟疫情（分别在陇南市和兰州市）的严峻防控形势，本着对畜产品安全和人民生命财产安全负责的态度，对发生的任何有相关症状的病料进行极速检测，这与王惜婧[4]对非洲猪瘟疫情的防控对策相一致，石丽娟[5]在《探析非洲猪瘟及防控措施》一文中也提出了类似建议。为进一步加强甘肃省非洲猪瘟防控措施，扩大监测面，下一步研究中，取样将进一步扩大范围，增加与其他省市接壤乡镇的病死猪检测力度。