金花茶组植物种质资源遗传多样性的iPBS分析

2020-12-10卢家仕黄展文李先民孙明艳余海娟周锦业李春牛卜朝阳

西南农业学报 2020年8期

卢家仕，黄展文，李先民，孙明艳，余海娟，周锦业，李春牛，卜朝阳

(广西农业科学院花卉研究所，广西南宁 530007)

【研究意义】金花茶(CamellianitidssimaChi.)是山茶科(Theaceae)山茶属(CamelliaL.)金花茶组植物，其天然种群主要分布在我国广西南部和越南北部，云南、贵州、四川也各分布1种[1-2]，是茶花家族中唯一具黄色花瓣的种类，属于国家一级珍稀保护植物，也是世界上的珍稀观赏植物，被誉为“茶族皇后”、“植物界中的大熊猫”和“幻想中的黄色山茶”。此外，金花茶还具有抗氧化[3]、抗肿瘤[4]、降血脂[5]、降血糖[6]和降血压[7]等多种药用价值。通常，以金花茶为母本、其他各色山茶为父本进行远缘杂交育种是培育黄色山茶新品种的有效途径[8-9]。分子标记技术在分子辅助育种中发挥着重要作用，且不受外界环境因素影响，分子标记辅助育种相对于传统育种省工省时，可根据育种目标提前检测后代是否具有相应的目标基因[10]，其中iPBS分子标记技术是一种基于反转录转座子技术，具有操作简单、重复性好、多态性高等特点[11]，已成功应用于牡丹[12]、枸杞[13]、菊花[14]等园艺植物的遗传多样性分析，但在金花茶遗传多样性分析上的应用至今未见报道。因此，利用iPBS分子标记技术分析金花茶种质资源的遗传多样性，进一步了解其遗传结构和亲缘关系，对其异地保护、杂交亲本选育和开发利用具有重要意义。【前人研究进展】在金花茶遗传多样性的分子研究方面应用较多的分子标记技术主要有RAPD、ITS序列、ISSR、AFLP、SSR和SNP标记技术。施苏华等[15]以RAPD分子标记技术分析11种金花茶植物间的遗传相似性，构建了系统发育进化树。唐绍清等[16]应用ITS序列探讨了金花茶组植物的系统发育关系。肖政等[17]利用ISSR分子标记技术将南宁金花茶公园29份资源划分为三大类群，其中扶绥中东金花茶聚为一类，顶生金花茶和龙州金花茶聚为一类，其余金花茶聚为一类。李辛雷等[18]以AFLP分子标记技术对金花茶4个天然种群进行遗传多样性分析，结果发现金花茶天然种群的遗传变异主要存在种群内，种群间遗传变异较小。Xu等[19]应用SSR分子标记技术鉴定金花茶杂交种的真伪，结果显示除H2外其余杂交种均为来自于相应父母本的真杂种。唐健民[20]运用SSR分子标记技术对4个东兴金花茶野生居群进行遗传多样性和结构分析，结果显示各居群的多态百分率为100 %，且遗传多样性较丰富，遗传分化主要在居群内部。刘凯等[21]利用开发的SNP分子标记技术从基因组水平进行了不同金花茶种质遗传关系分析。与传统分子标记技术(RAPD、ISSR和AFLP)相比，iPBS分子标记的品种鉴别能力更强[22]。【本研究切入点】目前，未见利用iPBS分子标记技术对金花茶种质资源进行遗传多样性和亲缘关系分析的研究报道。【拟解决的关键问题】采用iPBS分子标记技术对金花茶组植物不同种质资源进行遗传多样性和亲缘关系分析，了解其遗传结构和亲缘关系，为其品种鉴定和杂交亲本选育提供参考依据。

1 材料与方法

1.1 试验材料

供试24份金花茶组植物种质资源主要种植在广西农业科学院花卉研究所金花茶种质资源圃内，其信息见表1。采集供试材料的嫩叶，用蒸馏水清洗后提取其基因总DNA。

表1 试验材料名称及来源

1.2 DNA提取与检测

参照Biospin全能型植物基因组DNA提取试剂盒说明提取金花茶组植物DNA。用1.0 %琼脂糖凝胶电泳和NanoDrop One核酸蛋白测定仪(美国NanoDrop产品)检测DNA的浓度和纯度，DNA浓度用ddH2O统一调整为10 ng/μl后置于-20 ℃保存备用。

1.3 引物筛选与PCR扩增

50条iPBS引物由生工生物工程(上海)股份有限公司合成，用毛瓣金花茶和夏石金花茶DNA样品(2份)对其进行初步筛选，从中选取扩增产物条带清晰、多态性好的引物对本研究24份金花茶组植物种质资源进行PCR扩增。PCR反应体系20.0 μl：2×ExTaqMix 10.0 μl，ddH2O 7.5 μl，iPBS引物1.0 μl，DNA
1.5 μl。扩增程序：95 ℃预变性3 min；95 ℃变性30 s，39.0～43.5 ℃ 30 s，72 ℃ 2 min，进行35个循环；72 ℃ 延伸5 min，4 ℃保存。取7.0 μl PCR扩增产物用于1.2 %琼脂糖凝胶电泳，结果用BIO-RAD凝胶成像系统(美国)检测，并拍照保存。

1.4 统计分析

人工读取和统计PCR扩增产物检测结果，有条带的记为1，无条带的记为0，用POPGEN
1.32导入[0，1]数据矩阵计算多态性比率(%)、观察等位基因数(Na)、有效等位基因数(Ne)、Shannon多样性信息指数(I)和Nei基因多样性指数(H)，并把[0，1]数据矩阵从Excel 2003中导入NTsys 2.10e，用DICE法计算遗传相似系数，用UPGMA法构建系统发育进化树。

2 结果与分析

2.1 DNA提取结果

参照Biospin试剂盒说明提取的金花茶组植物DNA无蛋白质和RNA污染，无拖尾现象(图1)。经检测，金花茶组植物DNA浓度在40～70 ng/μl间，纯度较高，即DNA提取符合iPBS分子标记试验要求。

M：DNA marker DL2000；1～24与表1的金花茶种质编号对应，下同 M： DNA marker DL2000；1-24 corresponded to numbers of C. sect. chrysantha Chang germplasm resources in table1.The same as below图1 24份金花茶组植物种质资源的DNA电泳结果Fig.1 The electrophoresis map of genomic DNA in tested 24 C. sect. chrysantha Chang germplasms resources

表2 10个iPBS引物的PCR扩增结果

2.2 PCR扩增与引物筛选结果

用2份金花茶基因组DNA对50条iPBS引物进行初步筛选，获得10条扩增效果较理想的引物(表2)，利用该10条引物对所有供试材料分别进行PCR扩增，共统计到清晰条带280条(平均每条引物扩增条带数为28条)，其中多态性条带268条，多态性比率为92.68 %；扩增条带数最多的引物为iPBS 2076，共扩增出41条条带，最少的为iPBS 2080，仅扩增出13条条带。说明供试材料间的异质性较高，遗传多样性丰富。图2和图3分别是引物iPBS 2078和iPBS 2251对所有供试材料DNA的PCR扩增结果。

2.3 金花茶组植物的遗传多样性分析结果

Na、Ne、H和I是衡量遗传多样性水平的常用指标。用POPGENE
1.32计算得到多态性比率为92.68 %，24份金花茶组植物种质资源的平均Na、Ne、H和I分别为1.9571、1.3544、0.2332和0.3767(表3)。利用10条引物扩增的位点建立24份金花茶种质资源的遗传相似系数矩阵，计算获得遗传相似系数为0.543～0.836(表4)，其中，小花金花茶与库克芳金花茶间的遗传相似系数最小，为0.543，说明其亲缘关系最远，而毛籽金花茶与弄岗金花茶间的相似系数最大，为0.863，说明其亲缘关系最近。

图2 引物2078对24份金花茶组植物种质资源iPBS分子标记的扩增结果Fig.2 Amplification results of 24 C. sect. chrysantha Chang germplasm resources with primer 2078 by iPBS molecular marker

图3 引物2251对24份金花茶组植物种质资源iPBS的扩增结果Fig.3 Amplification results of 24 C. sect. chrysantha Chang germplasm resources with primer 2251 by iPBS molecular marker

表3 24份金花茶组植物种质资源的遗传多样性指数

表4 24份金花茶组植物种质资源的遗传相似系数

2.4 聚类分析结果

在获得遗传相似系数矩阵后，利用SHAN模块UPGMA构建24份金花茶组植物种质资源的亲缘关系树状图。从图4可看出，在遗传相似系数0.680处，10条iPBS引物可将24份金花茶组植物种质资源聚为3组，分别是Ⅰ、Ⅱ和Ⅲ组。其中，第Ⅰ组有9份金花茶种质，在遗传相似系数0.690处被分为a和b两个亚组，a亚组包括防城普通金花茶、毛瓣金花茶、小花金花茶和东兴金花茶4份种质，b亚组包括中东金花茶、崇左金花茶、薄叶金花茶、凹脉金花茶和显脉金花茶5份种质；第Ⅱ组有11份金花茶种质，在遗传相似系数0.703处被分为c和d两个亚组，c亚组包括陇瑞金花茶、天峨金花茶、柠檬黄金花茶和库克芳金花茶4份种质，d亚组包括夏石金花茶、毛籽金花茶、弄岗金花茶、平果金花茶、龙州金花茶、顶生金花茶和罗斯曼金花茶7份种质；第Ⅲ组包括4份金花茶种质，在遗传相似系数0.712处被分为e和f两个亚组，e亚组包括红顶金花茶、多毛金花茶和隆安金花茶3份种质，f亚组只有黄抱茎金花茶1份种质。

图4 24份金花茶组植物种质资源的iPBS分子标记树状聚类结果Fig.4 Dendrogram of 24 C. sect. Chrysantha Chang germplasms resources based on iPBS molecule marker

3 讨论

iPBS是Kalendar等[10]提出以LTR类反转录转座子保守位点设计引物扩增的分子标记技术，是对LTR类反转录转座子中两个PBS(引物结合位点)区间进行PCR扩增，无需预先知道相关的LTR序列，比常规的分子标记技术更有优势[23]。本研究中，以iPBS分子标记分析24份金花茶组植物种质资源的多态性比率为92.68 %，高于宾晓芸[24]利用RAPD、ISSR和AFLP分子标记分析的多态性比率及肖政等[17]以ISSR分析的多态性比率，说明iPBS分子标记多态性高，扩增条带多，实验操作要求不高，利用琼脂糖凝胶电泳即可观察分析结果，而传统分子标记(ISSR、SCoT、SSR、RAPD和AFLP)虽较稳定、可靠、操作简便，不受外部环境条件干扰，但也存在一些缺点[25]，如AFLP分子标记需高质量的DNA模板及制胶技术，RAPD分子标记重复性较差，SSR和cqSSR分子标记的引物开发较困难。唐健民等[26]研究也认为SSR分子标记的引物开发步骤繁琐，工作量大，费用高。唐绍清等[16]研究显示，用nrDNA ITS区引物扩增的PCR产物需纯化和测序，最后经序列分析，操作较iPBS繁琐，且GC含量较高(超过70 %)。

本研究结果表明，在遗传相似系数0.680处，10条iPBS引物可将24份金花茶组植物种质资源聚为3组，其中，第Ⅰ组中a亚组由普通金花茶、毛瓣金花茶、小花金花茶和东兴金花茶组成，b亚组的崇左金花茶与中东金花茶相聚，薄叶金花茶、凹脉金花茶与显脉金花茶相聚，崇左金花茶与凹脉金花茶聚为同一亚组，与肖政等[16]的研究结果一致，但与其扶绥中东金花茶单独为一组的研究结果不一致；凹脉金花茶与显脉金花茶相聚与张宏达[27]的分类结果一致，二者的主要区别在于凹脉金花茶嫩枝和叶背有毛，而显脉金花茶嫩枝和叶背无毛；毛瓣金花茶、薄叶金花茶与凹脉金花茶聚在一组的研究结果与叶创兴和许兆然[28]的研究结果一致，主要区别是毛瓣金花茶和薄叶金花茶的鳞芽和子房均有毛，而凹脉金花茶的鳞芽和子房均无毛。第Ⅱ组中c亚组由陇瑞金花茶、天峨金花茶、柠檬黄金花茶和库克芳金花茶组成，前3种为广西种质聚为一亚组的结果与肖政等[17]的研究结果相似，库克芳金花茶为越南引进种，聚类结果与前3种相近，不同点主要在于长势很旺，一年可多次抽稍；d亚组由夏石金花茶、毛籽金花茶、弄岗金花茶、平果金花茶、龙州金花茶、顶生金花茶和罗斯曼金花茶(越南引进种，主要特点是花黄色，花朵较小，嫩叶易焦枯[29])组成，其中毛籽金花茶和弄岗金花茶相似系数最大，为0.836，该2种与陇瑞金花茶共聚在第Ⅱ组，与闵天禄和张文驹[30]将毛籽金花茶、弄岗金花茶、大样弄岗金花茶、大茶金花茶、陇瑞金花茶和多瓣金花茶归并到淡黄金花茶的观点一致；龙州金花茶和顶生金花茶聚在同一亚组的结果与肖政等[17]的研究结果一致；在施苏华等[15]的研究中，龙州金花茶、毛籽金花茶、陇瑞金花茶和弄岗金花茶聚为一亚组，再与另一亚组的夏石金花茶等聚为一组，本研究结果与其相似。第Ⅲ组有4个金花茶种质，除隆安金花茶为广西种外，其他3个均为越南引进种。其中，e亚组包括红顶金花茶、多毛金花茶和隆安金花茶，红顶金花茶与多毛金花茶的相似系数为0.725，区别在于红顶金花茶花色金黄，花朵直径大，单株花朵产量高，具有较好的耐晒性[31]，多毛金花茶花淡黄色，花瓣无蜡质，嫩枝具有浓密绒毛[25，32]；隆安金花茶主要特点是花期较早，11月底至12月初始开；f亚组只有黄抱茎金花茶1种，与其他3种的区别在于花期略早，嫩叶紫红色，叶基部呈耳状抱茎，嫩枝光滑无毛[32]。

iPBS分子标记是一种新型标记，随着金花茶种质资源的不断丰富，其聚类结果与现有分子标记研究结果相比，一致的和相似的结果居多，同时也有部分聚类结果不一致。