不同遗传背景甜糯双隐性玉米种质的SSR鉴定

宋俏姮，孔亮亮，刘俊峰，杨跃华，张 垚，高必军

(四川省农业科学院水稻高粱研究所，四川 德阳 618000)

【研究意义】甜加糯型玉米是满足不同地区和不同人群对鲜食玉米品质更高消费需求的新类型，综合了甜玉米和糯玉米优点，入口“既甜又糯”，风味营养口感更佳，近些年已成为鲜食玉米选育的一个新方向[1-3]。在选育甜糯双隐性玉米自交系的基础上，通过与单或多隐性纯合体杂交组配，即可获得甜(杂结合)糯(纯结合)的玉米杂交种，播种后收获的果穗即为甜加糯型玉米[4]。因此，甜糯双隐性玉米自交系是配制甜加糯型玉米的必备中间材料。【前人研究进展】从遗传连锁关系上分析，甜质基因与糯质基因可转育到同一自交系中，获得甜糯双隐性纯合体[5]。甜质基因在糖分累积和淀粉总量上具有隐性上位作用，甜糯双隐性纯合体的籽粒表现为甜质，外观和口感与甜玉米类似，仅凭肉眼观察和品尝难以准确判断[5-7]。常规甜、糯玉米杂交组配F1选择分离比例为4/16的甜粒鉴定基因型，其中有1/16的甜糯双隐性籽粒(sh2sh2wxwx)；F1选择分离比例为3/16的糯粒继续播种自交，其中2/3的果穗分离出3/4糯粒(Sh2-wxwx)，1/4表型为甜质的双隐性籽粒(sh2sh2wxwx)[4，8]，但F1挑选糯粒时易出现误选，影响创制准确性。甜、糯玉米染色体杂交手段可控性差、变异大[9]，需鉴定分离后代的基因型。SSR分子标记鉴定法利用与目标基因(waxy)紧密连锁的遗传标记对特定性状(糯性)基因型进行选择，可在后代群体中直接筛选出含有目标基因(waxy)的甜糯双隐性纯合体(sh2sh2wxwx)[10]。李新海等报道了与糯质基因(waxy)紧密连锁的3对SSR引物(phi022、phi027、phi061)[11]。杨耀迥等基于SSR分子标记技术，筛选出的9株甜糯双隐性玉米单株经过4代连续自交，得到稳定的甜糯双隐性玉米自交系[12]。【本研究切入点】目前尚未见针对不同遗传背景获得的甜糯双隐性玉米种质进行SSR鉴定的报道，亟需探索一种方便准确的甜糯双隐性玉米种质鉴定体系，以简化育种程序，降低育种成本。【拟解决的关键问题】本研究利用与糯质基因(waxy)紧密连锁的3对SSR引物，将分子标记鉴定技术应用于3种不同遗传背景获得的甜糯双隐性玉米材料的筛选中，旨在对比分析不同创制方法的准确性和效果，解决选育甜糯双隐性玉米自交系的技术瓶颈，为甜糯双隐系的选择提供更加简便、高效的方法，提高育种效率和育种的预见性。

1 材料与方法

1.1 材料

供试玉米材料为YH03-01×HJ03-34，对照(CK)材料为H00-1。糯玉米自交系YH03-01、H00-1和超甜玉米自交系HJ03-34均为四川省农业科学院水稻高粱研究所自育。

1.2 方法

1.2.1 材料组配 常规甜、糯玉米杂交组配。选取优良糯玉米自交系YH03-01与优质超甜玉米自交系HJ03-34杂交，杂交组合YH03-01×HJ03-34自交授粉1代，在果穗上选择表型为甜质的籽粒，种植于四川省农业科学院水稻高粱研究所试验地，获得84份供试材料；同时，在果穗上选择表型为糯质的籽粒，继续播种自交1代，从收获的果穗上挑取甜质籽粒种植于四川省农业科学院水稻高粱研究所试验地，获得186份供试材料。

甜、糯玉米染色体杂交。亲本糯玉米自交系YH03-01和超甜玉米自交系HJ03-34由四川省农业科学院水稻高粱研究所提供，甜、糯玉米染色体杂交过程由深圳市百绿生物染色体杂交研究所完成，获得84份供试材料。

1.2.2 DNA提取 在供试材料幼苗期(4～6叶)剪取嫩叶，以优良糯玉米自交系H00-1的叶片作为对照(CK)，放入取样袋并编号，迅速带回实验室。采用改良CTAB法提取玉米叶片总DNA。将新鲜叶片在液氮中速冻，研磨成粉末，转入2 mL离心管中。加入65 ℃预热的500 μl CTAB抽提液，使用前在CTAB中加入0.2 % β-巯基乙醇，轻轻混匀，在65 ℃水浴中温浴30～60 min，期间每隔10 min颠倒混匀。加入500 μl的氯仿：异戊醇(24∶1)，轻轻充分混匀，10 000 r/min离心10 min。取上清至新的1.5 mL离心管中，加入与上清等体积的异丙醇，混匀，-20 ℃静置30 min，沉淀DNA。10 000 r/min离心10 min，弃废液。用600 μl 70 %乙醇漂洗两次，10 000 r/min离心2 min，室温下干燥，根据DNA含量用超纯水溶解。用1 %琼脂糖凝胶电泳检测DNA浓度和质量，并将DNA样品浓度稀释至50 ng/μl，-20 ℃保存备用。

1.2.3 SSR引物的选择与确定 采用李新海等[11]报道的与糯玉米隐性基因(waxy)紧密连锁的3对SSR标记引物：phi022、phi027、phi061。在MaizeGDB上搜索其引物序列，由成都擎科梓熙生物技术有限公司合成。用优良糯玉米自交系YH03-01(母本)验证是否能成功标记，标记成功的引物用于后续PCR扩增。

1.2.4 PCR扩增 PCR反应在美国Applied Biosystems公司生产的GeneAmp-9700 PCR仪上进行。PCR反应体系为20 μl：其中包括2.5 U/μlTaqDNA聚合酶0.25 μl，10×TaqBuffer 2.00 μl，25 mM MgCl22.00 μl，2.5 mM dNTP
1.50 μl，5 μM SSR引物2.00 μl，50 ng/μl DNA模板1.50 μl，ddH2O 10.75 μl。PCR反应程序为：94 ℃预变性3 min，1个循环；94 ℃变性30 s，56 ℃复性30 s，72 ℃延伸1 min，共35个循环；72 ℃终延伸5 min。

1.2.5 聚丙烯酰胺凝胶电泳 PCR扩增产物用10 %非变性聚丙烯酰胺凝胶在120 W恒功率下电泳分离1 h后，按照银染程序进行固定、漂洗、染色、漂洗、显影，最后拍照保存。

1.2.6 数据统计分析 扩增产物在电泳结果中与对照(优良糯玉米自交系)具有相同条带的即为含有目标基因waxy的样品，在田间对应编号的植株即为甜糯双隐性sh2sh2wxwx玉米单株。不同遗传背景的供试材料获得甜糯双隐性玉米单株的比例采用下列公式分别计算。甜糯双隐性纯合体比例=(同一背景获得的甜糯双隐性植株数/同一背景获得的供试植株数)×100 %。

2 结果与分析

2.1 DNA浓度和质量

模板DNA的浓度和质量与PCR扩增结果密切相关。模板DNA浓度，特别是其中待扩增目的基因的原始拷贝数以及DNA的纯度、长度和完整性是影响PCR扩增效率和特异扩增片段检出率的重要因素。从图1可知，本试验提取的玉米叶片总DNA质量和纯度较高，浓度适宜，长度完整，可用于后续PCR扩增。

2.2 SSR引物检测

以优良糯玉米自交系YH03-01(母本)DNA为模板，对与糯玉米隐性基因(waxy)紧密连锁的3对SSR引物phi022、phi027、phi061进行选择与确定。从图2可知，3对SSR引物对糯质亲本的扩增条带清晰单一，且处于同一迁移率位置，均能成功标记。

图1 部分DNA琼脂糖凝胶电泳结果Fig.1 Detection results of partial DNA agarose gel electrophoresis

2.3 SSR标记结果分析

以优良糯玉米自交系H00-1为对照(CK)，利用phi022、phi027、phi061对3种不同遗传背景获得的354份材料进行SSR甜糯双隐基因型鉴定。PCR扩增结果显示：①引物phi027在354份供试材料与对照CK间无明显多态性。②引物phi022对常规甜、糯杂交F1在甜质背景下选育的84份材料和F1在糯质背景下选育的186份材料扩增出来的带型完整清晰，重复性好，可明显标记基因型(图3)；用于甜、糯染色体杂交手段获得的84份材料，扩增条带则较为模糊。③引物phi061对甜、糯染色体杂交手段获得的84份材料进行PCR扩增，图谱条带稳定清晰，可直接判断目标基因是否存在；而用于常规甜、糯杂交F1在甜质背景下选育的84份材料和F1在糯质背景下选育的186份材料，扩增条带模糊不清，或者材料与对照CK间无多态性。

由于SSR标记的共显性特征，可分辨纯合基因型个体或杂合基因型个体，根据PCR扩增结果：①利用引物phi022，常规甜、糯杂交F1在甜质背景下选育的84份材料中与对照CK处于同一位点的样品有16个，在田间对应编号的植株即为甜糯双隐性纯合基因型sh2sh2wxwx玉米单株，甜糯双隐基因型纯合体的比例为19.05 %，甜质纯合基因型sh2sh2WxWx玉米材料19份，甜质杂合基因型sh2sh2Wxwx玉米材料为49份。②利用引物phi022，F1在糯质背景下选育的186份材料的扩增产物在电泳结果中与对照CK均具有相同的图谱条带，即此遗传背景下甜糯双隐性纯合体的比例为100.00 %。③利用引物phi061，鉴定出甜、糯染色体杂交手段获得的84份材料中有39份甜糯双隐基因型玉米纯合体，38份甜质纯合基因型sh2sh2WxWx材料，7份甜质杂合基因型sh2sh2Wxwx材料，甜糯双隐基因型纯合体的比例为46.43 %。SSR鉴定选择出的甜糯双隐性玉米种质连续套袋自交，可进一步纯化繁殖成甜糯双隐性玉米自交系，有效简化育种程序、降低育种成本。

3 结论与讨论

甜糯双隐性玉米籽粒表型为甜质，默认其含有甜质基因，本研究基于SSR分子标记鉴定技术，利用与糯玉米隐性基因waxy紧密连锁的SSR标记引物phi022、phi027、phi061，筛选出含有糯质基因的个体，即为甜糯双隐性玉米种质。杨耀迥等[12]利用这3对SSR引物对S1甜质家系筛选甜糯双隐性玉米种质时发现，引物phi022扩增效果较好，并成功鉴定出9株甜糯双隐性玉米单株，而phi027和phi061扩增条带模糊甚至残缺不全。宫捷等[13]使用同样的3对SSR引物在3份糯玉米自交系L33、L35和L38和1份甜玉米骨干系M01之间进行多态性检测时发现，引物phi022和phi027在亲本间无差异，而引物phi061条带清晰完整且有明显多态性，可用来鉴定sh2sh2wxwx甜糯双隐性纯合体。本研究中3对SSR引物对糯质亲本的扩增条带清晰单一，且处于同一迁移率位置，引物phi022可成功标记常规甜、糯杂交F1在甜质背景下选育的84份材料和F1在糯质背景下选育的186份材料的基因型，但用于染色体杂交手段获得材料的标记时则较模糊；引物phi061对甜、糯染色体杂交手段获得的84份材料可明显判断目标基因是否存在，用于常规甜、糯杂交获得的材料时条带模糊不全，或材料与对照CK间无多态性；引物phi027在354份供试材料与对照CK间无多态性。结合影响分子标记鉴定效果的因素分析，材料的遗传背景，性状的遗传率，标记定位精度以及与目标基因连锁程度，标记的特异性和在材料间的多态性，PCR反应条件，均可影响检测的准确性和效率以及性状对MAS的响应[14]。

图3 引物phi022部分扩增产物图谱Fig.3 Electrophoresis of partial amplified products with primer phi022

常规甜、糯玉米杂交组配是创制双隐性材料最常用的方法之一[5]，甜、糯玉米杂交后获得普通玉米(Sh2sh2Wxwx)种子，后代植株选株自交或彼此交，依据遗传自由组合定律，F1果穗上有9/16普通玉米籽粒(Sh2-Wx-)、3/16糯质籽粒(Sh2-wxwx)、4/16甜质籽粒[8]。其中4/16的甜粒中有1/16的甜糯双隐性玉米籽粒(sh2sh2wxwx)，3/16超甜玉米籽粒(sh2sh2Wx-)，甜糯双隐性籽粒占甜粒数的25 %。本研究F1在甜质背景下选育的84份材料中鉴定出16份甜糯双隐性材料，比例为19.05 %，与理论值近似，差值部分推测为甜糯双隐性材料种子活力差、出苗率低，出苗数低于播种数造成。苏彩霞等[4]研究发现常规甜、糯玉米杂交F1果穗上3/16的糯粒播种自交1代后，1/3的果穗表现全糯(Sh2Sh2wxwx)，2/3的果穗分离出3/4糯质籽粒(Sh2-wxwx)，1/4表型为甜质的双隐性籽粒(sh2sh2wxwx)，甜糯双隐性籽粒占甜粒比例为100 %。本研究F1在糯质背景下选育的186份材料中标记出186份甜糯双隐性材料，即此遗传背景下甜糯双隐性纯合体的比例为100 %，与理论值吻合。目前尚未见通过甜、糯玉米染色体杂交手段获得双隐性材料的相关报道，笔者委托深圳市百绿生物染色体杂交研究所以糯玉米作供体制成染色体片段导入甜玉米(受体)细胞，被导入的染色体片段和受体细胞内原有的染色体发生融合杂交，再通过组织培养和筛选获得一批材料，为验证此创制方法的可行性，对获得的84份材料进行了SSR鉴定，其中甜糯双隐性玉米纯合体有39份，比例为46.43 %。本研究结果表明不同遗传背景获得双隐性材料各有优缺点，常规甜、糯杂交F1果穗上选择甜粒所需代次少，分离比例较高，但外观难以与甜粒区分，须鉴定基因型，增加工作环节；F1果穗上选择糯粒，该背景获得双隐性籽粒所需代次较多，分离比例低，但可省略鉴定环节。甜、糯染色体杂交技术可控性差，分离比例变异大，还需进一步观察该技术的成熟度。

目前对于甜糯双隐性玉米材料的研究仍处于探索阶段，快速准确的判断甜糯双隐性玉米是开展后续工作的前提。在鉴定过程中，育种者普遍采用糯玉米作为测验种判断甜糯双隐性玉米种质[15]，但测交鉴定法依赖于植株的表型选择，容易受外界环境影响，工序繁琐，耗费时间长，工作量大，效率低。SSR分子标记技术可通过与目标基因紧密连锁或共分离的功能标记直接锁定目标基因，简便快速、遗传稳定，已广泛应用于作物的遗传改良和聚合育种[16-17]。分子标记鉴定法对基因型直接进行选择，不受环境、发育时期和基因表达等因素限制，与传统测交鉴定相比具有显著优势，极大的提高了选择效率，但SSR分子标记鉴定法不能脱离常规育种手段单独使用。因此构建饱和的分子标记遗传图谱，提高定位精度，寻找到背景选择适宜的标记，利用目标基因两侧连锁的分子标记同时进行选择[18]，并根据育种需要结合传统鉴定方法和创新不同的鉴定手段，可显著提高甜糯双隐性玉米自交系的选择效率和准确性。