玉米大斑病菌不同致病小种StBCK1基因生物信息学分析

2020-12-10周树功张晓雅张运峰

西南农业学报 2020年8期

周树功，张晓雅，张运峰

(1.唐山师范学院数学与信息科学系，河北唐山 063000；2.唐山师范学院生命科学系，河北唐山 063000)

【研究意义】玉米大斑病(Northern Corn Leaf Blight)是一种严重威胁玉米生产的真菌性病害，在全球温湿地区的玉米产地均有发生，在我国华北、东北地区的春玉米产区和南方海拔较高、气温较低的山区较易流行，发生严重的年份感病品种减产50 %左右[1]，已经成为玉米生产中的重要限制因素[2]。BCK1同源基因在致病真菌中具有细胞完整性、分生孢子发育及色素形成方面具有作用[3]，从分子水平确定基因的功能位点，不仅有利于阐明Slt2-homolog途径作用机制，还对寻找防治玉米大斑病菌的新作用靶点奠定基础。【前人研究进展】许多植物病原真菌的生长发育都受到胞外信号转导途径的调控，如MAPK、cAMP及Ga2+途径等，尤其是MAPK 途径对植物病原真菌生长发育和致病性调节作用的研究较多[3]。通过进一步研究发现，在玉米大斑病菌中存在4种MAPK信号通路，分别是Fus3/Kss1-homolog、Slt2-homolog、Hog1-homolog、Ime2-homolog，4种途径有着不同的功能：Fus3/Kss1-homolog途径首先是活化的StSte11激活StSte7，活化的StSte7激活StKss1，被激活的StKss1再激活其他下游靶蛋白参与调控附着胞后期发育及病菌的侵入过程；Slt2-homolog途径首先活化的StBCK1激活StMkk1，StMkk1激活StSlt2调控附着胞的侵入及致病性、分生孢子的形成的过程；Hog1-homolog途径主要参与调控病菌的胁迫反应及致病性[4]；Ime2-homolog为一条新发现的MAPK 级联途径[5]。StBCK1作为Slt2-homolog途径的关键因子具有重要作用，参与细胞壁的完整性、分生孢子形成与侵染等。【本研究切入点】虽然StBCK1在玉米大斑病的发育中起到重要作用，但StBCK1功能的关键位点尚不清楚菌。本研究拟通过研究不同生理小种的StBCK1基因和蛋白的差异位点，阐明StBCK1基因差异，初步确定StBCK1蛋白的功能位点。【拟解决的关键问题】本研究将确定StBCK1基因功能结构域在不同小种间的保守性，寻找该基因的差异位点，阐明位点差异对蛋白功能的潜在影响。

1 材料与方法

1.1 菌种

玉米大斑病菌01-23(1号，Ht2 Ht3 Htn /Ht1)，11-52A(1N号，Ht2 Ht3 /Ht1 Htn)，11-07D(13号，Ht2 Htn/Ht1 Ht3)，11-29E(0号，Ht1 Ht2 Ht3 Htn/0)菌株由河北农业大学真菌毒素试验室馈赠。

1.2 试剂

真菌基因组提取试剂盒，TA克隆试剂盒，rTaq酶及StBCK1引物由生工(上海)生物技术公司合成。70 % 乙醇、CTAB、氯仿、异戊醇、β-巯基乙醇、无水乙醇均为国产分析纯。

1.3 方法

1.3.1 菌丝体培养和收集将保藏菌株接种于PDA固体培养基上，28 ℃培养，培养5 d。将在培养基上生长5 d左右的菌丝接入装有液体培养基的三角烧瓶中，100 r/min,28 ℃恒温培养5～6 d。

1.3.2 基因组DNA的提取和检测利用CTAB法提取玉米大斑病菌的基因组。琼脂糖凝胶检测玉米大斑病菌基因组DNA。取2 μl DNA样品检测DNA质量。

1.3.3StBCK1基因结构域PCR和克隆 PCR体系(50 μl)：10×PCR buffer 5 μl，dNTP 3 μl，StBCK1-L(5’-TACCCCAGGACCATCTACCCAG-3’)3 μl，StBCK1-R(5’- GCAATAGACAGAGACCAGAAC AGTG-3’)3 μl，0.5 μl rTaq聚合酶，加ddH2O至50 μl。反应过程：95 ℃ 5 min，94 ℃ 1 min，55 ℃ 90 s，72 ℃ 90 s,40。利用1.0 %TAE琼脂糖凝胶、3～5 V/cm电泳检测。

1.3.4StBCK1基因结构域克隆和测序电泳结束后利用北京艾德莱生物科技有限公司琼脂糖凝胶纯化回收试剂盒纯化、回收正确的PCR扩增产物。StBCK1基因片段的TA克隆链接参照《TA克隆试剂盒说明书》进行。经过Amp抗生素筛选、PCR鉴定和质粒提取，获得PUC18-StBCK1克隆载体；克隆载体送华大基因测序。

1.3.5 生物信息学分析 ①以Et28a菌株的StBCK1的蛋白质ID号在UniProKB中搜索查找到该蛋白的InterPro信息，利用GraphView到InterPro里找到蛋白质激酶结构域的位置；②利用DNAMAN软件将测序小种的DNA序列与Et28a菌株的StBCK1结构域序列比对，确定NY001和被测小种5个菌株的功能结构域；③利用DNAMAN软件进行6个功能序列对比，确定SNP位点；④利用MEGA软件对6个小种基因的蛋白质序列进行比对，分析蛋白质的突变位点情况；⑤将蛋白质序列在DNAMAN中进行等电点分析及二级结构预测。

2 结果与分析

2.1 基因组DNA的检测和StBCK1基因的扩增

提取玉米大斑病菌的基因组DNA，通过琼脂糖检测显示条带均一且细直亮没有弥散的情况(图1)，说明DNA未出现断裂、裂解；以及用微量分光光度计检测其浓度和纯度，检测结果显示浓度均达到了200 ng/μl以上，纯度显示无蛋白质和RNA污染，说明提取的玉米大斑病菌的基因组DNA符合下游PCR扩增的实验条件。

2.2 StBCK1蛋白质激酶结构域序列位置

通过NCBI数据检索获得StBCK1蛋白质激酶结构特征，发现StBCK1蛋白质激酶结构域在DNA序列的4155～5016位，肽链的1385～1672位(图2)。

2.3 StBCK1基因功能结构域序列的SNP分析

通过比较玉米大斑病菌不同小种的StBCK1基因的功能结构域序列发现，11-29E与其它小种相比，第2位碱基由G突变为T，发生了颠换； 01-23、NY001和其他4种菌株相比，第243位碱基由C突变为T，发生了转换； 11-29E与其它小种相比，第860位碱基由A突变为T，发生了颠换(图3)。

图1 基因组DNA的琼脂糖凝胶检测Fig.1 Detection of genomic DNA by agarose gel

图2 StBCK1蛋白激酶结构域的位置Fig.2 The location of the StBCK1 protein kinase domain

2.4 功能结构域氨基酸序列变化

在氨基酸序列的第1位氨基酸的比对(图4)发现11-29E与其他致病小种相比，氨基酸由丝氨酸变为异亮氨酸为错义突变，该变化会影响α螺旋的形成，使其含量减少，可能导致MAPK信号通路相关蛋白接受信号后同源二聚化的形成。第89位氨基酸的比对中01-23、NY001和其他4种菌株相比，氨基酸由亮氨酸变为苯丙氨酸为错义突变，该变化会利于形成β折叠，而β折叠可以起到稳定MAPKKK的三维构象的作用，进而对酶活性产生影响。11-29E菌株的第287位氨基酸与其它致病小种不同，氨基酸由天冬酰胺突变为异亮氨酸为错义突变，这个突变会影响氨基酸的疏水性质。

图3 DNA序列比对结果Fig.3 The alignment results of DNA sequence

图4 蛋白质序列比对Fig.4 The alignment results of protein sequence

图5 StBCK1基因的氨基酸序列磷酸化位点预测Fig.5 Predicted phosphorylation sites of deduced amino acid sequence of StBCK1 from Setospaeria turcica

2.5 StBCK1基因编码氨基酸序列的磷酸化位点分析

磷酸化和去磷酸化是细胞内信号传导的重要激活途径。用 NetPhos2.0 Server在线程序(http://www.cbs.dtu.dk/services/NetPhos/)对StBCK1基因所编码氨基酸序列中的 Ser、Thr 和 Tys 3 种氨基酸残基可能成为的磷酸化位点作出预测，由磷酸化位点分析可知，可能成为该蛋白激酶磷酸化位点的为5 个 Ser分别位于序列51/116/120/163/221号位；2 个 Thr分别位于序列的8/125号位；1 个 Tyr位于序列的286号位(图5)。

3 讨论

单核苷酸多态性(Single Nucleotide Polymorphism, SNP)为第三代分子标记技术，是近几年最有发展潜力的分子标记技术，具有多态性位点数量多、稳定性好等优点[6]，广泛用于肿瘤的发生[7-9]、植物性状的形成[10]等领域的研究。

在植物病菌真菌基因组中SNP的发生频率较高，平均每500～1000 bp个碱基中就有一个多态性位点[11]，通过对01-23、11-29E等4 个致病小种的SNP发生频率为0.35 %。DNA碱基的多态性变化改变了各小种StBCK1蛋白质氨基酸组成，尤其功能结构域氨基酸的变化可对蛋白的活性造成显著的影响，在第287位氨基酸由冬酰胺突变为异亮氨酸可以使氨基酸的疏水性质发生改变，而疏水作用是蛋白质折叠的主要驱动力，在保持蛋白质三级结构上起作用，可能参与活性中心的形成。推测该位点的多态性会对各小种StBCK1蛋白产生功能差异。与蛋白序列对结果结合分析，由于第1位序列中氨基酸由丝氨酸变为异亮氨酸，氨基酸的疏水性质也发生了改变，所以可能导致与它临近的第8位的Thr磷酸化位点受其影响，进入导致蛋白质内部位点不容易被磷酸化；287位氨基酸由天冬酰胺突变为异亮氨酸，氨基酸的输水性质和电荷量也发生了改变，可能使与其临近的第286位Tyr不易被磷酸化，导致蛋白质活性降低，从而使玉米大斑病菌的致病性减弱。细胞壁的完整性对玉米大斑病菌感染寄主有重要作用，导致分生孢子数目不足，附着胞不能形成侵染丝，使其致病性降低[12]，通过明确StBCK1在不同小种中的差异，推测这些位点变化是导致玉米大班病菌致病性差异重要因素。