凹纹胡蜂蜂巢不同部位黄酮、多酚、多糖提取工艺及抗氧化活性研究

杨新周，刘贵有，梁建平，杨 琦 ，郭云胶 ，田孟华

(1.德宏师范高等专科学校民族医药研究所，云南 芒市 678400； 2. 德宏职业学院，云南 芒市 678400；3. 德宏州科技情报研究所，云南 芒市 678400； 4.昭通市天麻研究院，云南 昭通 657000)

【研究意义】凹纹胡蜂 (VespavelutinaaurariaSmith) 属于膜翅目胡蜂总科胡蜂属，民间俗称葫芦蜂、白脚蜂、吊包蜂等[1-2]，主要分布于中国云南、四川、西藏等地[2]，胡蜂全虫可以入药，可用于治疗祛风、解毒等[2-3]。其中胡蜂的成虫、幼虫、蜂毒已经在食品、药品、保健品和生物防治中有一定应用[2]。2015版药典记载蜂房具有祛风、攻毒、杀虫、止痛的功效[4]。随着凹纹胡蜂人工养殖技术的成熟，蜂巢产量逐渐增多，但是对凹纹胡蜂蜂巢的开发鲜见研究，造成极大的浪费，研究凹纹胡蜂蜂巢中黄酮、多酚、多糖的提取工艺、抗氧化活性，可为凹纹胡蜂蜂巢的综合利用和进一步的开发提供一定依据。【前人研究进展】目前蜂巢中黄酮、多酚及抗氧化活性的研究主要集中蜜蜂蜂巢，对于凹纹胡蜂蜂巢中黄酮、多酚、多糖的提取研究相对较少，凹纹胡蜂的研究主要集中于养殖，营养成分、重金属含量、生物习性蜂毒药效等。【本文研究切入点】本研究以凹纹胡蜂蜂巢为实验材料，通过单因素和正交试验探究出提取黄酮、多酚、多糖最佳实验条件，如乙醇体积分数、提取温度、提取时间、料液比等条件的优化。【拟解决的关键问题】通过水浴回流提取-分光光度法同时提取、分析凹纹胡蜂蜂巢不同部位中黄酮、多酚、多糖含量。探究出乙醇体积分数、料液比、提取温度、提取时间等因素对提取效果的影响。建立同时提取胡蜂蜂巢中黄酮、多糖、多酚的最佳工艺，揭示胡蜂蜂巢不同部分中黄酮、多糖、多酚的分布规律和蜂巢提取液的抗氧化活性能力，为开发胡蜂蜂巢抗氧化有效成分奠定基础。

1 材料与方法

1.1 试验材料

凹纹胡蜂蜂巢由德宏师专食用药用昆虫研究所提供，并经德宏师专郭云胶教授鉴定为胡蜂科凹纹胡蜂蜂巢，蜂巢样品见图1。

1.2 试验方法

1.2.1 凹纹胡蜂蜂巢实验材料的制备 将采集的凹纹胡蜂蜂巢(巢脾、外壳、白色封膜)样品，在40 ℃下烘12 h，粉碎，过0.3 mm筛子，贮存备用。

图1 胡蜂蜂巢Fig.1 Vespa velutina auraria Smith hive

1.2.2 凹纹胡蜂蜂巢待测液的制备 在100 mL圆底烧瓶中加入胡蜂蜂巢样品1.0000 g，按料液比1∶50(g/mL)加入乙醇溶液，水浴回流提取4 h，过滤，定容至50 mL得胡蜂蜂巢待测液。

1.2.3 标准曲线的制作和样品测定 按照文献[5]、[6]、[7]制作黄酮、多酚、多糖标准曲线，芦丁(黄酮)标准曲线：Y=0.0137X-0.04，R2=0.9997；多酚线性方程为：Y=0.1097X+0.0116，R2=0.9992；多糖标准曲线方程为：Y= 0.0133X+ 0.0565，R2= 0.996。

分别移取蜂巢待测液2.0 、0.5 、0.1 mL代替芦丁、没食子酸、葡萄糖标准溶液，按照黄酮、多酚、多糖标准曲线制作方法测定胡蜂蜂巢提取液吸光度，分别按照式(1)、(2)、(3)计算黄酮、多酚、多糖含量[5-9]。

黄酮含量=(C1×稀释倍数×V)/1000/m

(1)

多酚含量=(C2×稀释倍数×V)/1000/m

(2)

多糖含量=(C3×稀释倍数×V)/1000/m

(3)

式中，C1、C2、C3分别为提取液总黄酮、多酚、多糖浓度，μg/mL；V为体积，mL；m为样品质量，g。

1.2.4 单因素试验 ①胡蜂蜂巢中黄酮、多酚、多糖提取效果与乙醇体积分数间的关系：称取凹纹胡蜂巢脾1 g，按料液比1∶50，分别加入20 %～100 %体积分数的乙醇溶液，80 ℃水浴回流提取3 h，过滤接着转至50 mL容量瓶中定容，分别测定胡蜂巢脾提取液中的黄酮、多酚、多糖的浓度，并计算其含量。②胡蜂蜂巢脾黄酮、多酚、多糖提取效果与料液比间的关系：称取凹纹胡蜂巢脾1 g，分别按料液比(1∶20～1∶60)加入60 %的乙醇溶液， 80 ℃水浴回流提取3 h，过滤转移至50 mL容量瓶中(料液比为1∶60样品需浓缩)，定容，分别测定胡蜂巢脾提取液中的黄酮、多酚、多糖的浓度，并计算其含量。③胡蜂蜂巢脾黄酮、多酚、多糖提取效果与温度之间的关系：称取凹纹胡蜂巢脾1 g，按料液比1∶50加入60 %的乙醇溶液，分别置于不同温度(60、70、80、90 ℃)水浴中回流提取3 h，过滤转移至50 mL容量瓶中定容，分别测定胡蜂巢脾提取液中的黄酮、多酚、多糖的浓度，并计算其含量。④胡蜂蜂巢脾黄酮、多酚、多糖提取效果与时间之间的关系：称取凹纹胡蜂巢脾1 g，按料液比1∶50加入60 %的乙醇溶液，80 ℃恒温水浴中分别回流提取1、2、3、4、5 h，过滤转移至50 mL容量瓶中定容，分别测定胡蜂巢脾提取液中的黄酮、多酚、多糖的浓度，并计算其含量。

1.2.5 正交试验 根据单因素实验，进行4因素3水平正交试验，实验设计见表1。

1.2.6 凹纹胡蜂蜂巢不同部位中黄酮、多酚、多糖的测定 以优化的提取条件，分别对凹纹胡蜂蜂巢巢脾、外壳、白色封膜进行提取并测定其中的黄酮、多酚、多糖含量。

表1 因素和水平

1.2.7 抗氧化能力测定 (1)DPPH·自由基清除率:移取质量浓度为24 μg/mL的 DPPH·溶液4.5 mL于10 mL比色管中，加入一定量胡蜂蜂巢脾提取液，无水乙醇定容至5 mL，避光放置0.5 h，在517 nm处测定其吸光度值，得A蜂，同法做空白试验，得A0。按照式 (4) 计算胡蜂蜂巢巢脾提取液清除率[5-6]。同法测定对照品抗坏血酸和凹纹胡蜂蜂巢外壳、白色封膜提取液清除DPPH·自由基活性能力。

DPPH·自由基清除率(%)=[(A0-A蜂)/A0]×100

(4)

(2)·OH自由基清除率:取不同体积的蜂巢提取液，加入蒸馏水至2.5 mL，依次加入9 mmol/L FeSO4溶液1.0 mL、9 mmol/L水杨酸-乙醇溶液0.5mL、8.8mmol/L H2O2溶液1.0 mL，置于37 ℃水浴中反应0.5 h，冷却至室温，于波长λmax=510 nm处测定吸光度值得As。同法以0.5 mL蒸馏水代替水杨酸得对照组，吸光度为Ad，以2.5 mL蒸馏水代替样品得空白组吸光度为Ak。同时以VC作为阳性对照[10-12]。

羟基自由基清除率(%)=[Ak-(As-Ad]/Ak×100

(5)

(3)总抗氧化能力的测定:取不同浓度的蜂巢提取液1 mL，依次加入0.6 mol/L硫酸溶液1mL，28 mmol/L磷酸钠溶液1 mL，4 mmol/L钼酸铵溶液1 mL，置于90 ℃水浴中加热1.5 h，冷却至室温。在波长 695 nm 处测量吸光度。同法以1 mL蒸馏水代替蜂巢提取液作为空白对照，同时以VC为阳性对照[10,13]。

2 结果与分析

2.1 乙醇体积分数与胡蜂蜂巢脾中黄酮、多酚、多糖提取效果间的关系

从图2可见，胡蜂蜂巢脾中黄酮、多酚、多糖含量随着乙醇体积分数的升高而增大，当乙醇体积分数大于60 %，三者含量下降，所以单因素实验中选择乙醇体积分数为60 %。

2.2 胡蜂蜂巢脾黄酮、多酚、多糖提取效果与料液比间的关系

从图3可以看出，当料液比为1∶40时，胡蜂蜂巢脾中多糖含量最大为57.90 mg/g，料液比为1∶40时，胡蜂蜂巢脾中多糖含量为57.14 mg/g，两者相差0.66 mg/g。当料液比为1∶50时，胡蜂蜂巢脾中黄酮、多酚含量最大。实验中为兼顾三者的含量，所以单因素实验选择料液比为1∶50。

2.3 胡蜂蜂巢脾黄酮、多酚、多糖提取效果与温度之间的关系

从图4可见，胡蜂蜂巢脾中黄酮、多酚、多糖含量随着温度的升高而增大，当温度高于80 ℃时，三者含量开始降低，因此单因素实验中选择温度为80 ℃。

2.4 时间与胡蜂蜂巢脾黄酮、多酚、多糖提取效果间的关系

从图5可见，黄酮、多酚含量随着提取时间的延长而增大，当时间大于4 h，黄酮、多酚含量出现下降趋势。多糖含量在3 h时，含量最大为57.95 mg/g，4 h时为57.33 mg/g，2个时间中多糖含量相差0.62 mg/g，但要兼顾黄酮、多酚的含量，综合考虑单因素实验选择提取时间为4 h。

图2 乙醇体积分数与胡蜂蜂巢脾中黄酮、多酚、多糖提取效果间的关系Fig.2 The relationship between the extraction effect of flavonoids, polyphenols and polysaccharides in the comb of Vespa velutina auraria Smith hive and ethanol volume fraction

图3 料液比与胡蜂蜂巢脾黄酮、多酚、多糖提取效果间的关系Fig.3 The relationship between the extraction effect of flavonoids, polyphenols and polysaccharides in the comb of Vespa velutina auraria Smith hive and the ratio of solid to liquid

2.5 正交试验

从表2可以看出，以胡蜂蜂巢黄酮为指标，4个影响因子极差R大小顺序为B>D>A>C；以胡蜂蜂巢多酚为指标， R大小顺序为D>A>B>C； 以多糖为指标，R大小顺序为D>A>C>B。A1B3C3D3组合中多酚和多糖含量最大，分别为20.09、59.15 mg/g，此时黄酮含量为13.75 mg/g;A2B3C1D2组合中黄酮含量最大为15.06 mg/g，而此时多酚和多糖含量分别为17.73、49.00 mg/g;与A1B3C3D3组合相比，多酚和多糖含量较低。所以综合考虑黄酮、多酚、多糖含量，最佳提取工艺选择A1B3C3D3。

2.6 胡蜂蜂巢不同部位黄酮、多酚、多糖分布情况

从表3可以看出，胡蜂蜂巢不同部位黄酮、多酚、多糖含量成分差异较大，其中中黄酮、多酚、多糖含量依次为巢脾>外壳>封口膜。蜂巢巢脾主要为胡蜂分泌物构造而成是胡蜂主要居住场所，封口膜为胡蜂从体内吐出的物质构成，而外壳主要为胡蜂应用树皮等材料构造，因为构成基础不同，导致了胡蜂巢不同部位中黄酮、多酚、多糖含量差异。

图4 温度与胡蜂蜂巢脾黄酮、多酚、多糖提取效果间的关系Fig.4 The relationship between the extraction effect of flavonoids, polyphenols and polysaccharides in the comb of Vespa velutina auraria Smith hive and the temperature

图5 胡蜂蜂巢脾黄酮、多酚、多糖提取效果与时间之间的关系Fig.5 The relationship between the extraction effect of flavonoids, polyphenols and polysaccharides in the comb of Vespa velutina auraria Smith hive and the time

2.7 胡蜂蜂巢不同部位提取液抗氧化活性

2.7.1 DPPH·自由基清除率 测定了胡蜂蜂巢不同部位提取液清除 DPPH·自由基活性，并计算出清除 DPPH·自由基 IC50，通过研究发现，蜂巢巢脾、外壳、封口膜对DPPH·自由基活性具有一定的清除能力，实验得出外壳、巢脾、封口膜的清除DPPH·自由基IC50分别为0.27、0.073、0.64 mg/mL。Vc清除 DPPH·自由基IC50为0.0028 mg/mL。

2.7.2 ·OH自由基清除率 ·OH自由基十分活跃，能与体内活性物质发生反应，导致其失活，甚至可致癌等[9]。实验中测试了胡蜂蜂巢不同部位提取液清除·OH自由基活性能力，并计算出清除·OH自由基 IC50，通过研究发现，蜂巢巢脾、外壳、封口膜对·OH自由基活性具有一定的清除能力，外壳、巢脾、封口膜的清除·OH自由基IC50分别为3.97、2.44、2.46 mg/mL。Vc清除·OH自由基IC50为0.10 mg/mL。

2.7.3 总抗氧化能力 本方法为磷钼络合物的测定方法，Mo(Ⅵ)被抗氧化剂还原为 Mo(Ⅴ)，生成绿色络合物。在最大吸收波长695 nm 处，吸光度越高，物质抗氧化活性越强[9]。实验得出，总抗氧化能力随着提取液浓度的增大而升高。其中同种浓度下胡蜂不同部位的吸光度值大小为：蜂巢脾>蜂壳>封口膜。其中Vc浓度远小于胡蜂蜂巢不同部位提取液浓度，但其吸光度均高于胡蜂巢不同部位。说明胡蜂巢不同部位总抗氧化能力顺序为Vc>蜂脾>蜂壳>封口膜。说明总氧化能力可能与胡蜂巢不同部位中黄酮、多酚、多糖存在一定关系。

表2 L9(34)正交试验结果

表3 黄酮、多酚、多糖在胡蜂蜂巢不同部位中的分布

3 讨 论

蜂巢中黄酮、多酚、多糖随着乙醇体积分数(低于60 %)的升高而增大，当乙醇体积分数高于60 %，三者含量降低，这可能与三者的极性有关。当料液比大于1∶50时，三者含量降低，可能是随着溶液体积的增加，溶液吸收了部分热量，其余成分也被提取出来，导致三者含量减小。随着提取时间的延长和提取温度的升高，蜂巢中三者物质被破坏，发生不可逆变化，三者含量下降。

凹纹胡蜂蜂巢巢脾主要为胡蜂分泌物构造，封口膜为胡蜂从体内吐出的物质构成，而外壳主要为胡蜂应用树皮、唾液等材料筑造，因为构成基础不同，导致胡蜂巢不同部位中黄酮、多酚、多糖含量存在差异，黄酮、多酚、多糖含量依次为巢脾>外壳>封口膜。蜂巢不同部位清除DPPH·自由基、·OH自由基、总抗氧化能力顺序为巢脾>外壳>封口膜。其抗氧化能力可能与黄酮、多酚、多糖含量有一定的关系。通过此研究，可为胡蜂蜂巢的开发提供一条途径，为胡蜂蜂巢抗氧化活性物质的分离奠定基础。

4 结 论

实验结果表明，水浴回流同时提取胡蜂蜂巢不同部位中黄酮、多酚、多糖的最佳提取条件为乙醇体积分数为 50 %，温度85 ℃，时间3.5 h，料液比1∶35。根据优化提取工艺测定了胡蜂蜂巢不同部位中黄酮、多酚、多糖含量，依次为巢脾>外壳>封口膜。测定了胡蜂蜂巢不同部位提取液抗氧化活性，外壳、巢脾、封口膜和Vc清除DPPH·自由基、·OH自由基、总抗氧化能力顺序为Vc>巢脾>外壳>封口膜。说明胡蜂蜂巢具有一定的抗氧化活性，但均小于Vc。外壳、巢脾、封口膜3种成分的含量大小顺序与其抗氧化活性能力一致，说明3种物质的含量与抗氧化能力之间存在一定的联系。